钟 钰，郑 琴*，胡鹏翼，黄小英，杨 明*，任桂林，张科楠，李 菁

1江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 创新药物与高效节能降耗制药设备国家重点实验室，南昌 330004；2西南医科大学附属中医医院，泸州 646000

失眠是睡眠中断或睡眠时间减少所引起的一种睡眠障碍，主要表现为睡眠时间和睡眠深度的不足。据专家估计，到2020年全球大约有7亿多失眠者。大量的失眠症患者伴有不同程度抑郁、焦虑症状，导致患者精神活动效率下降，造成病人免疫功能下降、植物神经功能紊乱，增加糖尿病、冠心病、老年痴呆症等的患病风险[1]。治疗失眠比较常见的药物主要包含苯二氮卓类、非苯二氮卓类、具有镇静作用的抗抑郁药等几种类型[2]，长时间使用易产生依赖性、耐受性、戒断症状、反跳作用等各种不良反应。长期以来人们寄希望于通过天然植物来达到更安全、不良反应更小的治疗目的，越来越多的学者热衷于探求新的、安全的辅助或替代疗法以治疗失眠。研究发现，芳香植物精油通过吸嗅疗法具有良好的镇静催眠作用，相比口服药物安全性强，可避免日间宿醉、首过消除和对胃肠道刺激。沉香精油[3]、川芎精油[4]、佩兰精油[5]吸入给药均具有镇静催眠作用，可显著减少动物自主活动，缩短睡眠潜伏期，延长睡眠时间。在复方精油的相关研究方面，一种用甜牛至精油、德国甘菊精油和薰衣草精油调配而成的复方精油[6]和以左旋芳樟醇为主要原料配制的复方精油[7]均具有安眠功效。

本实验基于芳香疗法理论为指导，研究一种以薰衣草精油、甜橙精油、檀香精油等多种具有镇静催眠、抗焦虑、抗抑郁的芳香植物精油配伍的复方安神精油吸入给药的镇静催眠作用，采用GC-MS分析复方安神精油挥发性化学成分以及入脑的主要化学成分，基于网络药理学探讨复方安神精油治疗失眠症的作用机制，旨在为复方安神精油通过芳香疗法治疗与改善失眠症提供理论依据。

1 材料

1.1 试验动物

6～8周龄ICR小鼠，雌雄各半，体重25～35 g，江苏集萃药康生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(苏)2018-0008。

1.2 主要药品与试剂

复方安神精油，江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室提供，批号20180715，主要成分为薰衣草精油、甜橙精油、檀香精油等；地西泮片(北京益民药业有限公司，批号H11020898)；戊巴比妥钠(德国Merck公司，批号20171230)；生理盐水注射液(江西科伦药业有限公司，批号C18081701)；吐温-80(上海三浦试剂公司，批号：20180323)；乙醇消毒液(南昌利康药械实业有限公司，批号18041601)；氢氧化钠(西陇化工股份有限公司，批号20180227)；三氯甲烷(西陇科学股份有限公司，批号20170705)；乙醚(国药集团化学试剂有限公司，批号20180601)。

1.3 主要设备及仪器

超声雾化香薰机(深圳市康美太实业有限公司)；动物香薰室(有机玻璃制成的50×50×40 cm大箱结构，其内部放置4个20×20×20 cm可通气体的小箱结构，中间可放置超声雾化香薰机)；SMART行为记录视频分析系统(Panlab公司)；Agilent 7890A气相色谱-5975质谱联用仪(美国安捷伦公司)。

1.4 网络药理学软件与数据库

TCMSP数据库(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)、Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) 、OMIM数据库(http://www.omim.org/)、TTD 数据库(https://db.idrblab.org/ttd/)、Drugbank数据库(https:// www.drugbank.ca/)、Cytoscape 7.0 软件。

2 方法

2.1 动物分组及给药

选用ICR小鼠，雌雄各半。实验期间，动物可得到足够的食物和水。实验间饲养环境的温度为21±1 ℃，湿度55%±5%，明暗交替12 h，自由饮水和进食，适应性喂养1周后开始实验。实验设空白组(正常喂养)，3个复方安神精油组(吸入给药1天组、吸入给药7天组及吸入给药14天组)，3个阳性药组(阳性药给药1天组，阳性药给药7天组及阳性药给药14天组)。复方安神精油各组小鼠每天吸入浓度为2×10-3的复方安神精油(预实验测得的有效吸嗅浓度，复方安神精油用浓度为1%的吐温-80溶液稀释)，将超声雾化香薰机置于动物香薰室中，使药物充分挥发弥漫整个香薰室内，再将复方安神精油各组小鼠依次置入香薰室中，盖上箱盖，连续吸入给药60 min，吸嗅时间段为每日8:00～16:00。地西泮用蒸馏水配制成0.1 mg/mL的溶液，阳性药各组灌胃地西泮溶液，给药剂量为1 mg/kg(根据成人临床剂量采用体表面积等效剂量比值换算成小鼠等效剂量)，空白组和复方安神精油各组灌胃等体积的蒸馏水。

2.2 小鼠自主活动测试

各组小鼠于末次给药30 min后，对每组小鼠分别进行自主活动测试。小鼠适应环境5 min，计数3 min内小鼠移动的距离和站立次数等行为学参数，比较各组小鼠间的差异。自主活动测试指标：移动距离，单位：cm；最大速度，单位：cm/s；平均速度，单位：cm/s；静止时间，单位：s；站立次数。

2.3 戊巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期与睡眠时间

自主活动测试完毕后，各组小鼠分别腹腔注射阈剂量45 mg/kg(预实验测得引起100%小鼠睡眠的最小剂量)的戊巴比妥钠，于给药前用生理盐水配制戊巴比妥钠溶液。以给药后小鼠翻正反射消失达1 min为入睡指标，注射药物至翻正反射消失的时间为睡眠潜伏期，翻正反射消失至恢复所经历的时间为睡眠时间，记录小鼠睡眠潜伏期与睡眠时间。

2.4 统计学处理

2.5 复方安神精油的化学成分与入脑的化学成分分析

2.5.1 脑组织样品的制备

选取10只SD大鼠，雌雄各半。大鼠每天鼻腔给药20 μL的复方安神精油，连续鼻腔给药7天，于第7天鼻腔给药完毕30 min后处死，取出全脑，生理盐水洗净，再加入生理盐水2 mL匀浆，离心，取上清液1 mL，加入2 mol/L NaOH 50 μL，三氯甲烷2 mL振摇，离心，取出三氯甲烷层，10只合并，挥干，加入乙醚2 mL，微孔滤膜过滤，即得[8]。

2.5.2 GC-MS色谱条件

气相色谱条件：采用Agilent DB-624(30 m×320 μm×1.8 μm)毛细管色谱柱，载气为高纯He(99.999%)，进样量为l μL，分流比40∶1，流速1 mL/min。升温程序：初始温度40 ℃(保持1 min)，以10 ℃/min升温至220 ℃，再以25 ℃/min 升温至280 ℃(保持9 min)。质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，MS四极杆温度150 ℃；接口温度250 ℃，溶剂延迟3.0 min，质量扫描模式全扫描，扫描范围30～650 amu。标准谱库 NIST11检索，峰面积归一法计算各组分相对百分含量。

2.6 基于网络药理学构建对复方安神精油活性成分-作用靶点网络图

利用TCMSP数据库、Pubchem数据库、OMIM数据库筛选出治疗失眠症的活性成分，将治疗失眠症的活性成分与复方安神精油主要化学成分取交集，得到复方安神精油治疗失眠症相关活性成分。利用TTD数据库、Drugbank数据筛选出治疗失眠症靶点以及复方安神精油活性成分靶点，将治疗失眠症靶点与复方安神精油活性成分靶点取交集,得到复方安神精油治疗失眠症相关作用靶点。将复方安神精油治疗失眠症相关活性成分和治疗失眠症相关作用靶点导入Cytoscape7.0软件,构建复方安神精油活性成分-作用靶点网络,预测和筛选出复方安神精油治疗失眠症关键性的作用靶点与活性成分。

3 结果与分析

3.1 小鼠自主活动测试实验结果

小鼠自主活动测试实验结果见表1。结果表明，与空白组比较，吸入给药1天组显示出镇静催眠作用，吸入给药7天和吸入给药14天组的镇静催眠作用极显著，小鼠的自主活动量极显著减少，表现为移动距离和站立次数极显著减少(P<0.01)、平均速度与最大速度极显著减小(P<0.01)、静止时间极显著增加(P<0.01)，阳性药给药1天组的镇静催眠作用极显著(P<0.01)，随着给药时间的的延长，阳性药给药7天、阳性药给药14天组的小鼠自主活动量增加。

3.2 戊巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期与睡眠时间的实验结果

戊巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期与睡眠时间实验结果见表2。结果表明，在睡眠潜伏期方面，与空白组相比，阳性药给药1天组的睡眠潜伏期极显著减少(P<0.01)，其次是吸入给药7天(P<0.01)、吸入给药14天组(P<0.01)，随着给药时间的延长，阳性药给药14天组的睡眠潜伏期有增加的的趋势；在睡眠时间方面，与空白组相比，阳性药给药1天组的睡眠时间极显著增加(P<0.01)，其次是吸入给药7天组(P<0.01)、吸入给药14天组(P<0.01)，随着给药时间的延长，阳性药给药14天组的睡眠时间有减少的趋势。

表1 复方安神精油对小鼠移动距离、平均速度、最大速度、静止时间、站立次数的影响

注：其他各组与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.

表2 复方安神精油对戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间的影响

注：其他各组与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.

3.3 复方安神精油的化学成分与入脑化学成分分析结果

复方安神精油的主要化学成分见表3，GC-MS分析复方安神精油成分TIC图见图1。鉴定出30个复方安神精油的化学成分，占挥发油总量的93.39%。复方安神精油主要成分为酯类、醇类、烯烃类、烷烃类等化合物，其中含量最高的是D-柠檬烯(24.07%)，其次是芳樟醇(21.98%)、乙酸芳樟酯(15.37%)，α-蒎烯(5.39%)，α-檀香醇(4.8%)等。复方安神精油入脑主要化学成分见表4，GC-MS分析复方安神精油入脑成分TIC图见图2。通过计算机自动检索标准谱库 NIST11，并与复方安神精油成分TIC图以及复方安神精油的主要化学成分进行比较，分析与鉴定出6个复方安神精油入脑的化学成分，分别是D-柠檬烯(D-Limonene),芳樟醇(Linalool),乙酸芳樟酯(Linalyl acetate),α-檀香醇(α-Santalol)，十九烷(Nonadecane)、二十烷(Eicosane)。

3.4 复方安神精油活性成分-作用靶点网络图构建与分析

基于复方安神精油化学成分的GC-MS分析结果，由数据库筛选得到复方安神精油治疗失眠症相关作用靶点见表5，复方安神精油治疗失眠症相关活性成分见表6，构建复方安神精油活性成分-作用靶点网络图见图3，图中共有64个节点，每条边代表活性成分与靶点间的相互作用。其中红色节点代表复方安神精油治疗失眠症相关的39个作用靶点，形状越大代表其关联的活性成分越多；绿色节点代表复方安神精油中25个治疗失眠症相关的活性成分；形状越大代表其关联的作用靶点越多。具有很高的Degree的节点为“中枢节点”，在整个复方安神精油活性成分-作用靶点网络中占据重要地位[9]。因此在复方安神精油活性成分-作用靶点网络图中预测NR1I2(孕烷X受体)、ESR1(雌激素受体)、NR1I3(组成性雄甾烷受体)、GABRA1(γ-氨基丁酸受体α1)、CYP19A1(细胞色素P450)、NR1H4(胆汁酸受体)靶蛋白与复方安神精油发挥镇静催眠作用密切相关。此外，预测和筛选Dibutyl phthalate、Caryophyllene、Geranyl acetate、Linalool、α-Terpineol、Terpinen-4-ol在复方安神精油治疗失眠症过程中发挥关键性作用。

图1 GC-MS分析复方安神精油成分TIC图Fig.1 GC-MS analysis of composite compound anshen essential oil TIC diagram

图2 GC-MS分析复方安神精油入脑成分TIC图Fig.2 GC-MS analysis of compound anshen essential oil into brain component TIC diagram

表3 复方安神精油主要化学成分

表4 复方安神精油入脑化学成分

图3 复方安神精油活性成分-作用靶点网络图Fig.3 Component-target network of compound anshen essential oil

4 结论

芳香吸入疗法中精油的芳香物质经鼻腔吸入后作用于嗅脑，促进神经物质的释放进而调控植物神经系统，调动体内积极因素并释放各种情感信息，从而达到治疗、防治疾病的目的[10]。由于鼻腔与脑组织之间存在着直接的解剖学通道，药物可通过鼻粘膜吸收，绕过血脑屏障直接转运入嗅球或脑脊液进而直接进入脑组织[11]。“吸嗅入脑”是一种无损性给药方式，最大限度地减少毒副作用，因此可能成为有效控制和治疗失眠等精神类疾病的给药途径。动物自主活动测试实验和阈剂量戊巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期与睡眠实验是治疗失眠症药物药效的常见评价方法。研究结果表明，复方安神精油具有镇静催眠作用，可显著减少动物自主活动，缩短睡眠潜伏期、延长睡眠时间，随着吸入给药时间的增加未表现出显著的药物耐受性。

表5 复方安神精油治疗失眠症相关作用靶点

表6 复方安神精油治疗失眠症相关活性成分

通过GC-MS追踪复方安神精油的挥发性化学成分，其中D-柠檬烯[12]、芳樟醇[13]、乙酸芳樟酯[14]、α-檀香醇[15]均已有报道证明具有中枢神经镇静作用；此外，D-柠檬烯具有抗焦虑、舒缓情绪的作用[16]，芳樟醇具有缓解抑郁样作用[17]，α-蒎烯具有抑制焦虑情绪[18]、缓解压力[19]等作用，推测复方安神精油的镇静催眠功效与其主要化学成分及活性相关。GC-MS分析复方安神精油入脑主要化学成分为D-柠檬烯,芳樟醇,乙酸芳樟酯,α-檀香醇，十九烷，二十烷。

基于网络药理学构建的复方安神精油活性成分-作用靶点网络图可以看出，在GC-MS追踪的30个复方安神精油的挥发性化学成分中，筛选出25个治疗失眠症相关活性成分作用于39个治疗失眠症相关作用靶点，其中作用靶点包括5-羟色胺受体、γ-氨基丁酸受体、肾上腺素受体、去甲肾上腺素受体、多巴胺受体、乙酰胆碱受体、食欲素受体以及胆汁酸受体等。因此复方安神精油治疗失眠症是通过多个成分作用于多个靶点产生效应，体现了复方安神精油多成分、多靶点的作用特点。预测复方安神精油主要通过NR1I2、ESR1、NR1I3、GABRA1、CYP19A1、NR1H4相关靶蛋白发挥药效作用，筛选出Dibutyl phthalate、Caryophyllene、Geranyl acetate、Linalool、α-Terpineol、Terpinen-4-ol在复方安神精油治疗失眠症过程中发挥关键性的作用。GC-MS追踪的30个复方安神精油的主要挥发性化学成分中含量最高的化学成分以及入脑的主要化学成分D-limonene、linalool、linalyl acetate、α-pinene、α-santalol、nonadecane具有治疗失眠症相关性并在复方安神精油活性成分-作用靶点网络图同样占据重要的地位。对网络药理学预测的关键靶点进行相关研究文献验证，孕烷X受体作为关键的转录调控因子参与多种药物代谢酶和转运蛋白的诱导表达，在机体异源性和内源性物质的代谢及排泄过程中起重要的调控作用，参与机体脂质、胆固醇和糖代谢从而维持机体内环境的稳态[20]。雌激素受体存在于脑的许多部位，广泛表达于与情感刺激加工有关的脑区域，如海马、杏仁核、下丘脑、额皮质和脊核，能影响人类各种认知、情感及行为，调节5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和单胺氧化酶，对中枢神经系统发挥重要的调控作用[21]。组成性雄甾烷受体经配体激活后可调控药物代谢酶及转运体的表达和活性，调节毒性物质的清除、解毒及代谢过程，保护机体免受外源性化学物质和内源性毒性脂质损伤，并参与糖、脂代谢和炎症等信号通路的调控[22]。γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物中枢神经系统的抑制性神经递质，γ-氨基丁酸(GABA)与失眠机制的发生及进展联系密切，其主要作用的受体为γ-氨基丁酸α型受体[23]。细胞色素P450主要分布在内质网和线粒体内膜上，参与生物体内的甾醇类激素合成等过程[24]，参与药物代谢并对细胞因子和体温调节具有重要作用。胆汁酸受体作为一种胆汁酸激活的核受体，参与机体多种生理活动的调节，包括胆汁酸代谢、脂代谢、糖代谢、肝脏保护等过程[25]，与抗胆碱能、镇静催眠等作用密切相关。基于网络药理学方法预测和筛选的复方安神精油活性成分均具有一定的镇静催眠作用相关性，其活性成分与作用靶点之间的关联性，在一定程度上证实复方安神精油镇静催眠作用研究以及复方安神精油主要化学成分与入脑的主要化学成分的GC-MS分析结果的可靠性。

研究表明，复方安神精油具有镇静催眠功效；复方安神精油的主要化学成分与入脑的主要化学成分中含有多种具有神经中枢镇静催眠作用以及抗焦虑、抗抑郁作用的挥发性化学成分；基于网络药理学预测和筛选出25个治疗失眠症相关活性成分作用于39个治疗失眠症相关作用靶点，体现复方安神精油多成分、多靶点的镇静催眠作用特点，上述结果与文献报道基本一致。本研究为基于芳香疗法理论指导下的复方安神精油发挥其镇静催眠功效与进一步深入阐明复方安神精油治疗失眠症的作用机制提供科学依据，并为探索治疗失眠症安全的辅助与替代疗法提供新途径。