姬晨曦，杜晶芳，王诗馨，安 南，赵颖清，于亚莉

（吉林大学食品科学与工程系，吉林长春 130062）

我国已有470多年的玉米栽培历史，除了小麦和水稻，玉米在粮食作物中居于第3位，目前我国的玉米种植量仅次于美国。玉米中所含营养素较为全面，玉米蛋白的制备和应用获得了广泛良好的来源。玉米蛋白粉是玉米淀粉在湿法加工中的副产物，其蛋白质含量达到50%以上，由于水溶性差、氨基酸不平衡，口感粗糙，所以在食品工业中的应用受到很大地限制[1-3]。故而绝大部分玉米蛋白并未物尽其用，造成了较大的浪费。玉米抗氧化肽的开发为玉米蛋白粉的深加工提供了契机。随着保健食品市场的扩展，开发玉米新型功能肽对于提高人类健康水平和促进食品工业发展具有重要的经济和社会意义。

近年来，玉米淀粉加工副产物已得到学术界的认可，逐渐将这些副产物进行综合利用，开发其潜在价值。已有人将玉米浆回收以制取抗生素、酶制剂、味精、蛋白饲料粉，做成发酵工业培养基，并提取菲酊，制备植酸和肌醇[4-6]；而玉米胚芽则成为磷脂的良好提取源，胚芽蛋白精制后用作饼干点心的蛋白添加剂等[7]；玉米蛋白粉则已用于提取玉米黄素，制备谷氨酸、生产醇溶蛋白等。玉米蛋白特殊的氨基酸组成和序列使其肽链中存在着不同的功能区，具有抗氧化等多肽功能[3，8-9]。利用玉米蛋白此特点已制备出具有各种生物功能的活性肽[3，10-11]。但针对于该研究还是相对较少，因而，玉米功能活性肽的研究与开发成为科研热点。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米蛋白粉，陕西森弗天然制品有限公司提供。

1.2 试剂

碱性蛋白酶，北京奥博星生物技术有限责任公司提供；胰蛋白酶，国药集团化学试剂有限公司提供；PBS，上海立菲生物技术有限公司提供；ABTS，NaOH，HCl和过硫酸钾等，以上均为分析纯。

1.3 仪器与设备

XMTD-8222型水浴锅，上海精宏实验设备有限公司产品；JJ-1型精密定时电动搅拌器，金坛市荣华仪器制造有限公司产品；Starter2C型pH计，奥豪斯仪器（上海） 有限公司产品；ME203E型电子天平，METTLERTOLTDO产品；CR20B2型高速冷冻离心机，日立公司产品；SCIENTZ-ⅡD型超声波细胞破碎仪，新芝公司产品；SynergyHT型酶标仪，BioTek公司产品；DG-800型漩涡混合器，北京鼎国昌盛生物技术有限公司产品；MH-2型微量振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 玉米蛋白肽的制备

玉米蛋白粉过80目筛→配制质量分数为8%的玉米蛋白粉溶液→搅拌均匀→超声功率500 W，时间10 min→在90℃下变性10 min→冷却至适宜温度→1 mol/L NaOH或HCl溶液调pH值至合适→同时加入10%碱性蛋白酶和定量胰蛋白酶→酶解→90℃下灭酶10 min→以转速8 000 r/min离心10 min。

1.4.2 蛋白质水解度的测定

pH-stat法[12]（当蛋白质酶解过程中在pH值＞6.5时）。

式中：DH——蛋白质水解度，%；

V——水解过程中用去NaOH的量，mL；

M——蛋白粉质量，g；

η——蛋白粉中蛋白质含量，%；

C——NaOH标准溶液的浓度，mol/L；

1.01 ——氨基酸的平均解离度，%；

8.38 ——每克蛋白质中肽键的克当量，mol/L。

1.4.3 玉米蛋白肽抗氧化活性的影响

ABTS·清除率测定方法[13]。用蒸馏水配制7 mmol/L的ABTS溶液，将ABTS溶液和过硫酸钾溶液（终浓度为2.45 mmol/L）按1∶1的体积比混合，配制得到ABTS储备液，并在室温条件下避光静置12～16 h后，用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH值7.4）将储备液稀释一定倍数（20～30倍），使其在波长734 nm处吸光度为0.7±0.02，形成ABTS工作液。用移液枪吸取180 μL的ABTS工作液至96孔板各孔中，然后每孔加入20 μL样品溶液，振荡10 s后，测定反应体系于波长734 nm处的吸光度。ABTS工作液现用现配。

试验分为3组：①空白组：每孔加200 μL PBS溶液；②对照组：180 μL ABTS工作液加20 μL PBS溶液；③试验组：180 μL ABTS工作液加20 μL样品溶液（稀释20倍）。每个样品浓度设置6个复孔，取平均值。ABTS+·清除率计算公式如下：

式中：X——ABTS自由基清除率，%；

As——试验组；

AC——对照组；

AB——空白组。

1.4.4 玉米蛋白酶解条件的确定

（1） 单因素试验。控制酶解酶底比（4%，6%，8%，10%，12%）、酶解pH值（7，8，9，10，11，12）、酶解温度 （45，50，55，60，65 ℃）、酶解时间（1，2，3，4，5 h） 其中的3个因素为定量，研究其中一个因素对制备玉米蛋白抗氧化肽的影响。

（2）正交试验设计。在此前单因素试验的基础上，以ABTS·清除率和玉米蛋白水解度为评价指标。确定正交试验的4个因素及3个水平进一步优化玉米蛋白酶解的工艺条件。

2 结果与分析

2.1 酶水解条件单因素试验

2.1.1 [E]/[S]对玉米蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影响

胰蛋白酶[E]/[S]依次为4%，6%，8%，10%，12%时，酶解温度55℃，pH值9.0，酶解4h后，以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率为主要衡量指标，玉米蛋白水解度为辅助性指标，分别测得二者随[E]/[S]变化的趋势。

[E]/[S]与玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的关系见图1。

图1 [E]/[S]与玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的关系

从图1可以看出，随着[E]/[S]的变化，玉米蛋白的水解度在胰蛋白酶质量分数4%～8%时，水解度变化明显，呈直线型，与水解速率基本成正比变化；而达到10%时水解速率明显下降；当达到12%时，水解度虽然有所增加，但是变化趋势已经趋于平缓。究其原因可能是底物质量分数和数量有限，从而限制了碱性蛋白酶和胰蛋白酶与底物的结合，导致水解度不会无限升高，后期变化趋势不明显并趋于平缓。

在[E]/[S]逐渐增加的情况下，制备所得玉米蛋白抗氧化肽活性逐渐上升，当[E]/[S]达到8%时，其抗氧化活性最大；当[E]/[S]＞8%时，玉米蛋白抗氧化肽ABTS·清除活性反而下降。当胰蛋白酶添加少量或者适量时，玉米蛋白底物能够与酶充分结合，水解产生的活性短肽逐渐增加，以至于粗提液的抗氧化活性增强；但蛋白酶添加过量时，会使已产生的多肽过度水解，得到分子量更小的肽段或游离氨基酸，导致具有较高自由基清除能力的多肽含量降低，使自由基清除能力降低[14]。

2.1.2 pH值对玉米蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影响

胰蛋白酶[E]/[S]为8%，酶解温度55℃，酶解时间4 h，pH值依次变化时，以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率为主要衡量指标，玉米蛋白水解度为辅助性指标，二者的变化情况。

pH值与玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的关系见图2。

图2 pH值与玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的关系

从图2可以看出，随着pH值的增加，玉米蛋白水解度处于上升趋势，在pH值为11时，水解度达到最大，pH值再次增加时，水解度渐次下降。水解度与蛋白酶的最适pH值息息相关。试验中使用了碱性蛋白酶和胰蛋白酶2种酶进行水解。而试验用碱性蛋白酶的最佳pH值处于9～12，胰蛋白酶则位于8～10。只有pH值处于合适的范围内，蛋白酶才能最大程度的发挥作用。前期当pH值处于7～10时，发挥水解作用的主要是胰蛋白酶，碱性蛋白酶效力较弱；当pH＞10时，碱性蛋白酶成为主要发挥作用的酶，而胰蛋白酶则由于所处环境过碱性，所以活力减弱，或许正是两者强弱配合使得玉米蛋白水解度在pH值为11时达到最大；当pH＞11时，pH值环境已然超过碱性蛋白酶和胰蛋白酶的最适范围，引起酶分子内部构象的改变即蛋白酶的部分变性，使得酶与底物不能有效结合，进一步导致水解度降低。而玉米蛋白水解液的抗氧化活性最初随着pH值的上升而增强，当pH值9.0时，玉米蛋白水解液的抗氧化活性达到最高；而pH＞9.0后，水解液的ABTS自由基清除活性急速下降。抗氧化活性的降低可能是由两部分原因引起：过碱的环境致使酶结构被破坏，碱性蛋白酶和胰蛋白酶水解玉米蛋白产生的抗氧化活性肽浓度较低；另一方面，虽然过碱环境破坏了部分酶结构，足够的时间内玉米蛋白仍然水解完全，但是强碱性环境对产生的玉米蛋白抗氧化肽的理化结构造成损伤，使其抗氧化活性降低，从而造成水解液抗氧化活性降低。

2.1.3 酶解温度对玉米蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影响

胰蛋白酶[E]/[S]为8%，pH值9.0，酶解时间4 h后，以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率为主要衡量指标，玉米蛋白水解度为辅助性指标，二者随酶解温度变化的情况。

酶解温度与玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的关系见图3。

图3 酶解温度与玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的关系

从图3可以看出，玉米蛋白水解度随着酶解温度上升而上升；当酶解温度达到55℃时，水解度最大；此后温度继续上升时，水解度则有较大幅度的下降。碱性蛋白酶和胰蛋白酶最适作用温度分别为55～70℃和40～60℃。酶解温度低于55℃时，碱性蛋白酶和胰蛋白酶的作用环境并未达到最适，相同水解时间内，玉米蛋白水解程度并不完全；而当酶解温度高于55℃时，胰蛋白酶结构已经不再稳定，酶活性降低，玉米蛋白水解度降低。

玉米蛋白抗氧化肽的抗氧化活性开始时随着酶解温度升高而升高，当酶解温度达到55℃时，水解液的抗氧化活性最高，酶解温度高于55℃时，水解液的抗氧化活性渐渐下降。酶解温度过高时，酶结构发生改变，酶活性降低，对玉米蛋白抗氧化肽的产生有不良影响。另一可能情况则是酶解温度过高时，蛋白酶活性降低，虽然产生了足够数量的玉米蛋白抗氧化肽，但高温使得玉米蛋白抗氧化肽的结构改变，ABTS·清除活性降低。

2.1.4 酶解时间对玉米蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影响

胰蛋白酶[E]/[S]为8%，酶解温度55℃，pH值9.0，以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS自由基清除率为主要衡量指标，玉米蛋白水解度为辅助性指标，二者随酶解时间的变化。

酶解时间与玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的关系见图4。

图4 酶解时间与玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的关系

从图4可以看出，随着酶解时间的延长，玉米蛋白水解度渐次上升，酶解时间达到4 h时，水解度达到最大，时间继续延长并不能使水解度继续上升，并且在误差范围内略有下降。随着酶解时间的延长，玉米蛋白分子结构较大程度改变，酶切位点暴露全面，水解度上升，但玉米蛋白底物含量有限，经过4 h后，酶解完全，时间继续延长并不能使水解度继续增加，因此保持平缓状态。

随着酶解时间的延长，ABTS·清除率显著增加。酶解时间为2 h时，ABTS·清除率最高，时间继续延长反而使得ABTS·清除率下降。出现这样的反应趋势是由于反应时间过长，碱性蛋白酶和胰蛋白酶促使玉米蛋白过度水解，产生分子量更小的肽甚至是游离氨基酸，使得具有自由基清除能力的多肽被破坏，影响了玉米蛋白抗氧化肽的活性[15]。另一方面可能是由于酶解时间过长，玉米蛋白酶解产生的有效抗氧化活性肽过度酶解，导致其ABTS·清除活性下降。

2.2 正交试验结果

在此前单因素试验的基础上，以ABTS·清除率为主要评价指标。通过正交试验进一步优化玉米蛋白酶解的工艺条件。

L9（34）正交试验因素与水平设计见表1，正交试验结果分析见表2。

从表2可以看出，方案设计中影响玉米蛋白水解度的主次顺序为D＞C＞B=A。极差分析显示，pH值是影响玉米蛋白水解度的关键因素。水解度优化的综合选择为A2B1C3D3，即[E]/[S]为8%，酶解时间2 h，酶解温度60℃，pH值9.0。酶解条件按此组合可获得玉米蛋白的最大水解度。根据表2～表5的方差分析发现pH值对水解度的影响极为显著，温度影响次之。

表1 L9（34）正交试验因素与水平设计

表2 正交试验结果分析

对抗氧化活性而言，胰蛋白酶[E]/[S]、酶解温度、pH值和酶解时间4个因素中影响玉米蛋白抗氧化肽清除ABTS·的主次顺序为C＞D＞B＞A。从极差分析中可以看出温度是酶解过程中影响玉米蛋白抗氧化肽ABTS·清除率的最主要因素，pH值次之，[E]/[S]的影响最小。各方面综合考虑，最终优选制备玉米蛋白抗氧化肽的最佳工艺条件为A1B1C3D3，即[E]/[S]6%，酶解时间2 h，酶解温度60℃，pH值9.0。工艺条件如此组合时，玉米蛋白抗氧化肽可以获得最高的ABTS·清除率。依据表4可得，酶解温度和pH值对玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率影响十分显著，时间影响相对较弱，[E]/[S]的影响则可以记为试验的误差列。

水解度的方差分析见表3，ABTS·清除率方差分析见表4。

综合考虑玉米蛋白水解度和水解液的抗氧化活性，可能因为试验过程中采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶共同控制水解，水解度和ABTS·清除率之间无必然的因果联系。而试验主要以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率为主要指标，因此，采用A1B1C3D3组合作为最终的制备工艺条件，以期能够同时获得较好的水解度和良好的玉米蛋白抗氧化肽。

表3 水解度的方差分析

表4 ABTS·清除率方差分析

3 结论

以玉米蛋白水解度和水解液的ABTS·清除率为检测指标，对碱性蛋白酶配合胰蛋白酶水解玉米蛋白的工艺条件进行了优化。在碱性蛋白酶用量固定的情况下，玉米蛋白水解的最适条件为酶解温度60℃，pH值9.0，胰蛋白酶[E]/[S]6%，酶解时间2 h。经过验证试验证明，在此条件下，玉米蛋白水解度为20.42%，水解液ABTS·清除率为90.06%±0.7%。与单因素试验和正交试验各组试验条件所得结果相比，经过正交试验优化筛选的试验条件能够同时获得令人满意的水解度和ABTS自由基清除率，并且试验结果更加稳定。