陈 鑫， 李然红， 刘 丹， 王立凤， 刘思言

(牡丹江师范学院，黑龙江 牡丹江 157012)

锌是植物必需的微量营养元素之一，锌指蛋白(Zinc finger proteins，ZFP)主要由半胱氨酸和组氨酸残基与Zn2+结合成立体结构[1]，且具有指状结构特征，RING-ZFPs是典型的锌指结构蛋白类型，具有保守结构域[2]。现已知锌指蛋白广泛分布在真核生物体中，在拟南芥植物中现已发现有176 种Cys 2 His 2型锌指蛋白[3]。低温、干旱等逆境胁迫能够诱导植物体内一些锌指蛋白基因发挥作用增强植物逆境胁迫能力。狗枣猕猴桃〔Actinidiakolomikta(Maxim.et Rupr.) Maxim.〕主要分布于我国东北、四川、河北、云南等地。其叶片颜色在生长的不同时期会发生变化，形成白色或紫红色彩叶，远观如桃花盛开又如梨花片片，极具观赏价值，其果实柔软多汁、酸甜可口、富含维生素C，是一种药食观赏兼用植物[4-6]，属于大型落叶藤本植物。RING型基因能够在拟南芥、烟草、辣椒、草莓、水稻等多种植物中鉴定出来，并在植物的生长发育、激素的信号传导及响应非生物胁迫等方面起到关键作用。KO等[7]研究表明,在拟南芥超表达RING时能够引起耐盐性的降低;GAO等[8]通过调节RING型基因改变ABA信号传导可以提高水稻的抗旱性；CHAE等[9]发现沉默CaAIRF1基因后的辣椒其ABA敏感性降低，干旱耐受性减弱。另外，LEE等[10]研究发现,拟南芥中的RING型基因表达变化时，其植株的冻害敏感性也发生变化。高温处理下植物叶肉细胞中的RING型基因能够调控H2O2的积累，进而提高植物的耐高温性[11]。目前，狗枣猕猴桃CHY基因的研究未见报道。因此，以狗枣猕猴桃转录组数据为参考，筛选到狗枣猕猴桃锌指蛋白(AkCHY)的cDNA序列，利用生物信息学方法对狗枣猕猴桃蛋白的理化性质、疏水性/亲水性、结构功能域、蛋白质修饰位点及同源性等方面进行预测和分析，为狗枣猕猴桃锌指蛋白(AkCHY)功能的研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料

狗枣猕猴桃AkCHY基因cDNA序列从牡丹江师范学院植物分子育种实验室转录组数据中获得；中华猕猴桃变种(Actinidiachinensisvar.chinensis PSS 14254.1)、茶树(CamelliasinensisXP_028125452.1)、毛果杨(PopulustrichocarpaXP_002314304.1)、胡杨(PopuluseuphraticaXP_011032318.1)、橡胶树(HeveabrasiliensisXP_021692080.1)、川桑(MorusnotabilisXP_024022996.1)、榴莲(DuriozibethinusXP_022730070.1)、麻疯树(JatrophacurcasXP_012064689.1)、大桉(EucalyptusgrandisXP_010031414.1)、葡萄(VitisviniferaRVW54207.1)、番木瓜(CaricapapayaXP_021908000.1)、枣树(ZiziphusjujubaXP_015898513.1)、欧洲栓皮栎(QuercussuberXP_023888973.1)、木薯(ManihotesculentaOAY51516.1)、石榴(PunicagranatumOWM68934.1)等15种植物氨基酸序列在NCBI数据库中下载。

1.2 方法

AkCHY的理化性质用ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)进行分析；NCBI-CDD进行保守结构域及蛋白家族预测(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)；Inter-ProtScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)预测功能位点；NetPhos3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)对N-糖基化位点进行预测；NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetOGlyc/)对O-糖基化位点进行预测；采用PredictProtein 数据库(https://www.predictprotein.org/)对AkCHY进行二级结构及蛋白质修饰位点预测；使用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)在线软件预测蛋白质三级结构。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获得15条不同植物的CHY氨基酸序列信息，利用MEGA 5.1的Neighbor-joining法构建蛋白质系统进化树。

2 结果与分析

2.1 AkCHY的理化性质

经分析表明，AkCHY基因cDNA全长为1 768 bp，编码区(CDS)为cDNA上第238～1 074个碱基，共编码279个氨基酸，分子量32 324.16 D，理论等电点为7.01，负电荷残基总数(Asp+Glu)为37，正电荷残基总数(Arg+Lys)为36，分子式为C1369H2125N413O407S45，总原子数4 359，不稳定指数(instability index,Ⅱ)为54.356，脂肪系数(Aliphatic index)为54.44，亲水性(GRAVY)的平均水平为-0.527。说明该蛋白为亲水非稳定性蛋白。该蛋白中含量最多的为半胱氨酸，占11.8%；其次为组氨酸，占7.5%；含量最少的为色氨酸，为0.4%(图1)，吡咯赖氨酸及硒半胱氨酸含量为0。通过ProtScale分析预测(图2)，该基因蛋白的整个肽链中均含有亲水性和疏水性氨基酸，得分最大值为1.967，在158个氨基酸处；最小值为-2.522，在第59个氨基酸处。从整体分布看，氨基酸的负值多且分值大，根据蛋白质亲水和疏水的得分判定该蛋白为亲水蛋白。结合理化性质分析得出该AkCHY基因为非稳定亲水蛋白。

图1 AkCHY基因编码蛋白质的氨基酸组成

Fig.1 Amino acid compositions of protein encoded by theAkCHYgene

图2 AkCHY的亲水/疏水性

Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of AkCHY

2.2 AkCHY的信号肽及跨膜结构

经SignalP-4.1预测AkCHY蛋白不含信号肽(图3)，同时不存在跨膜结构。

注：C值、S值和Y值分别是原始剪切位点、信号肽和综合剪切位点的分值。

Note:The C value,S value and Y value were the scores of original shear site,signal peptide and comprehensive shear site respectively.

图3 AkCHY的蛋白信号肽

Fig.3 Signal peptide of AkCHY

2.3 AkCHY的结构域

对AkCHY保守序列及蛋白家族预测(图4)表明,AkCHY是ZFP基因家族的ZF-CHY和zinc-ribbon-6成员(ID：11342810)，第18～100个氨基酸的序列区域为ZF-CHY组的保守结构域，第201～259个氨基酸的序列区域含有zinc-ribbon-6的锌带结构。另外，152～204个氨基酸存在RING-H2-Pirh2、RING-H2、RING-H2-BRAP2、HRD1、RING-H2-RNF24、COG5540、RING-Ubox等保守结构域。

图4 AkCHY的蛋白保守序列

Fig.4 Conservative protein sequence of AkCHY

2.4 AkCHY的二级、三级结构

对AkCHY的二级结构进行分析预测，该蛋白14%可能会形成螺旋，10%可能形成延伸链，76%为无规卷曲，无二硫键的形成，无特殊的二级结构。用SWISS-MODEL对AkCHY蛋白进行三级结构预测(图5)，该三级结构含有多个功能结构域，在第202～263个氨基酸的序列区域含有zinc-ribbon-6的锌带结构域，第5～146个和第147～238个氨基酸均有RING-H2保守结构。

图5 AkCHY蛋白的三级结构

Fig.5 Tertiary structure prediction of AkCHY protein

2.5 AkCHY的蛋白质修饰位点

对蛋白磷酸化位点预测，该蛋白存在磷酸化位点18个(图6)。对O-糖基化位点进行预测，预测分数均大于0.5，因此未阳性，故推测该蛋白内含5个O-糖基化位点分别在第3、48、265、268、267个氨基酸。由表1可见，AkCHY含有2个蛋白激酶磷酸化位点分别在第13、164个氨基酸处，4个酪蛋白磷酸激酶II磷酸化位点分别在第3、74、164、199个氨基酸处，4个十四烷酰化位点分别在第86、115、132、263个氨基酸处。

2.6 AkCHY的氨基酸序列同源性

AkCHY氨基酸序列与15种植物的CHY序列进行同源性分析(图7)表明，狗枣猕猴桃与中华猕猴桃原变种的亲缘关系较近，而与番木瓜等植物的亲缘关系较远。

图6 AkCHY蛋白的磷酸化位点

Fig.6 Phosphorylation site prediction of AkCHY protein

表1 AkCHY的修饰位点

图7 CHY系统进化树

Fig.7 System phylogenetic tree of CHY

3 结论与讨论

锌指蛋白作为真核生物中分布最广泛的基因调控因子，直接或间接参与植物的生长发育、根系建成、逆境响应及信号调节等生理生化过程，根据半胱氨酸和组氨酸残基的数目和位置分为C2H2、C4、C6、C4HC3等多种类型，根据功能结构分为PHD、DOF、RING型，在植物中具有高度保守基因序列。CHY基因含有RING型结构功能，与植物生长发育及非生物胁迫抗性功能相关，拟南芥中发现的RING型锌指蛋白基因与植物侧根发育有密切关系，同时还具备抗旱能力[12]。研究通过生物信息学方法得到AkCHY基因的基本理化性质及结构功能：该基因cDNA全长为1 768 bp，由279个氨基酸编码构成，通过理化性质及ProtScale分析出该蛋白为非稳定亲水性蛋白，无跨膜结构，二级结构主要构件为α-螺旋和不规则卷曲，三级结构中包含RING型结构及zinc-ribbon-6的锌带结构域，选取15条CHY氨基酸序列与AkCHY进行比对，经MAGA5.1分析，狗枣猕猴桃与中华猕猴桃原变种的亲缘关系较近，而与番木瓜等植物的亲缘关系较远。研究结果为进一步研究狗枣猕猴桃锌指蛋白CHY基因功能提供理论基础。