李然红， 陈 鑫， 刘 丹， 王立凤

(牡丹江师范学院，黑龙江 牡丹江 157012)

狗枣猕猴桃〔Actinidiakolomikta(Maxim.et Rupr.) Maxim.〕，别名狗枣子，常生于东北海拔800～1 500 m和四川海拔1 600～2 900 m山地混交林或杂木林中的开旷地。狗枣猕猴桃是我国较为耐寒的野生果树之一，叶色在红、白、绿间变化，变化诱因有待进一步研究，但极具观赏性，同时果实和叶均可药用，且狗枣猕猴桃是良好的蜜源植物[1-3]。锌指蛋白(Zinc finger proteins，ZFP)是一类具有螺旋指状结构和 Zn2+结合位点的转录因子，最早在非洲爪蟾中被发现[4]。根据其保守结构域中半胱氨酸和组氨酸的数目和位置可分为C2H2、C4、C6、C4HC3、C2HC、CCCH等多种类型[5]。锌指蛋白在转录和翻译水平上调控基因的表达，如Q-type ZFP 可以参与植物的根系调控以响应环境干旱[6]。ZFP参与植物的生长发育、形态建成、逆境胁迫应答等功能[7]。SENDON等[8]研究表明，拟南芥中的Atdwa1锌指C2H2蛋白能够影响植株的开花、叶片、矮小的生长发育。OsMSR15在水稻的不同生长发育阶段表现出对冷、热、干旱胁迫具有正调节作用，并在种子萌发期对ABA有超敏感性[9]。ZFP能够在低温、干旱、盐碱等胁迫环境中发挥重要作用，番茄、枳、烟草、大豆中的ZFP均在逆境环境中大量表达，巨桉的EgrZFP6能够参与胁迫响应的负调控，提高植物对低温的敏感性[10-11]。目前，植物锌指蛋白的研究已经取得显著进展，但有关狗枣猕猴桃基因组中锌指蛋白基因的研究相对较少。因此，筛选锌指蛋白的cDNA序列，利用生物信息学方法对狗枣猕猴桃锌指蛋白的理化性质、跨膜结构、结构功能域、蛋白质修饰位点及同源性等方面进行预测和分析，以期探明ZFP在狗枣猕猴桃应对长期低温胁迫中发挥的作用。

1 资料与方法

1.1 资料

狗枣猕猴桃锌指蛋白cDNA序列从牡丹江师范学院植物育种实验室转录组数据中获得；中华猕猴桃变种(PSS36210.1Actinidia chinensis var.chinensis)、罂粟(RZC69647.1 Papaver somniferum)、牛耳草(KZV33942.1 Dorcoceras hygrometricum)、野李变种(PQQ12403.1 Prunus yedoensis var.nudiflora)、浆果状辣椒(PHT42171.1 Capsicum baccatum)、土瓶草(GAV59596.1 Cephalotus follicularis)、甜椒(XP_016579619.1 Capsicum annuum)、克莱门柚(XP_006453394.1 Citrus clementina)、蜜柑(GAY37133.1 Citrus unshiu)、蓖麻(XP_002534087.1 Ricinus communis)、陆地棉(XP_016698842.1 Gossypium hirsutum)、雷蒙德氏棉(XP_012474223.1 Gossypium raimondii)、海岛棉(PPD80777.1 Gossypium barbadense)、葡萄(XP_010656831.1 Vitis vinifera)、榴莲(XP_022732478.1 Durio zibethinus)、橡胶树(XP_021655388.1 Hevea brasiliensis)等16种植物氨基酸序列在NCBI数据库中下载。

1.2 方法

AkZFP2的理化性质用ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)进行分析；NCBI-CDD进行保守结构域及蛋白家族预测(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)； NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk /services/ NetNGlyc/)对N-糖基化位点进行预测；NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetOGlyc/)对O-糖基化位点进行预测；采用 SOPMA及PredictProtein 数据库(https://www.predictprotein.org/)对AkZFP2进行二级结构及蛋白质修饰位点预测；使用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)在线软件预测蛋白质三级结构。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获得16条不同植物的ZFP氨基酸序列信息，利用MEGA 5.1的Neighbor-joining法构建蛋白质系统进化树。

2 结果与分析

2.1 AkZFP2的理化性质

经分析表明，AkZFP2基因cDNA全长为854 bp，编码区(CDS)为cDNA上第185～619个碱基，共编码145个氨基酸，分子量15 791.31 D，理论等电点为9.23，负电荷残基总数(Asp+Glu)为11，正电荷残基总数(Arg+Lys)为15，分子式为C682H1046N208O219S4，总原子数2 159，不稳定指数(instability index,Ⅱ)为63.05，脂肪系数(Aliphatic index)为55.24，亲水性(GRAVY)的平均水平为-0.806。说明该蛋白为亲水非稳定性蛋白。该蛋白中含量最多的为丝氨酸,占18.6%;含量最少的为缬氨酸，为0.7%(图1)。通过ProtScale分析预测(图2)，该基因蛋白的整个肽链中均含有亲水性和疏水性氨基酸，得分最大值为0.544，在109个氨基酸处；最小值为-2.467，在第87个氨基酸处。从整体分布看，氨基酸的负值多且分值大，根据蛋白质亲水和疏水的得分判定该蛋白为亲水蛋白。

图1 AkZFP2基因编码蛋白质的氨基酸组成

Fig.1 Amino acid compositions of protein encoded by theAkZFP2 gene ofActinidiakolomikta

图2 AkZFP2的亲水/疏水性

Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of AkZFP2

2.2 AkZFP2的信号肽及跨膜结构

经SignalP-4.0预测(图3)，AkZFP2蛋白不含信号肽，同时不存在跨膜结构。

注：C值、S值和Y值分别是原始剪切位点、信号肽和综合剪切位点的分值。

Note:The C value,S value and Y value were the scores of original shear site,signal peptide and comprehensive shear site respectively.

图3 AkZFP2的信号肽及跨膜结构

Fig.3 Signal peptide and transmembranne domain of AkZFP2

2.3 AkZFP2的结构域

经AkZFP2保守序列及蛋白家族进行预测(图4)表明，AkZFP2是ZFP基因家族的ZF-C2H2-6成员(PFAM13912)。

2.4 AkZFP2的二级、三级结构

经对AkZFP2的二级结构进行预测(图5)，该蛋白形成螺旋、延伸链、转角及无规卷曲的可能性分别为31.72%、13.10%、4.83%和50.34，无二硫键和特殊二级结构。用SWISS-MODEL对AkZFP2蛋白进行三级结构的预测(图6)表明，该结构主要构件为无规卷曲和螺旋，在第38～73个氨基酸中含有锌指C2H2结构域。

图4 AkZFP2的蛋白保守序列

图5 AkZFP2蛋白的二级结构预测

Fig.5 Secondary structure prediction of AkZFP2 protein

图6 AkZFP2蛋白的三级结构

Fig.6 Tertiary structure prediction of AkZFP2 protein

2.5 AkZFP2的蛋白质修饰位点

经预测，该蛋白内有1个潜在的N-糖基化位点，在第6个(NTSL)氨基酸处。经对O-糖基化位点预测，分数均>0.5预测是阳性，该蛋白内含20个O-糖基化位点。由表1可见，AkZFP2含有1个锌指C2H2型结构域序列；2个蛋白激酶磷酸化位点、3个酪蛋白磷酸激酶II磷酸化位点、3个十四烷酰化位点、1个酰胺化位点。

表1 AkZFP2蛋白的修饰位点

2.6 AkZFP2的氨基酸序列同源性

AkZFP2氨基酸序列与16种植物的ZFP序列进行同源性比对(图7)表明，狗枣猕猴桃与中华猕猴桃原变种的亲缘关系较近，而与罗布斯塔咖啡、蓖麻等植物的亲缘关系较远。

3 结论与讨论

锌指蛋白是目前真核生物中分布最为广泛的一类蛋白，在植物抵抗逆境胁迫中扮演重要角色。C2H2型锌指蛋白则是成员最多且研究较深入的一类，并拥有高保守的结构域，可通过与特定基因的DNA结合或特异性互作，从而影响植物的抗性功能及生长发育方面的调节[12]。目前已经从多种植物包括拟南芥、大豆、小麦、水稻、矮牵牛等中克隆到ZFP基因，研究的相关材料多为草本植物，藤本植物的ZFP基因研究未见报道。研究发现，ZFP基因在植物发育过程中起重要作用，拟南芥中ZFP基因缺失可导致植物腺毛数量下降，此外植物矮化、花枝退化都与ZFP基因相关[13-14]。ZFP基因其重要功能是与抗性相关，在干旱、盐、冷、外源激素胁迫中均发挥作用[15]。狗枣猕猴桃是东北地区抗逆性较强的植物，研究其ZFP基因与抗逆性功能关系，为进一步研究狗枣猕猴桃锌指蛋白基因功能提供了理论基础。结果表明：AkZFP2基因cDNA全长为854 bp，编码蛋白由145个氨基酸构成，不含跨膜结构，丝氨酸含量较高，属于ZF-C2H2-6蛋白家族(PFAM13912)，亲水性非稳定蛋白，结构中含有QALGGH高保守结构，狗枣猕猴桃与中华猕猴桃原变种的亲缘关系较近，而与蓖麻等植物的亲缘关系较远。

图7 ZFP系统进化树

Fig.7 System phylogenetic tree of ZFP