胡 毅， 王 微， 刘文锋， 鄢人雨， 何 洁， 潘承丹

(1.黔东南州农产品质量安全检测中心， 贵州 凯里 556000; 2.贵州大学， 贵州 贵阳 550001)

我国茶文化博大精深，源远流长，茶叶种类众多[1]。按照成品茶叶形状分类可分为卷曲形茶、扁形茶、针形茶、砖茶、条形茶、珠茶以及球形茶等[2-3]。不同类型茶叶的产地较多，但是球形茶目前就只有雷山银球茶[4]。雷山银球茶在1982年由毛克翕先生研制而成[5]，是贵州省雷山县特产，中国国家地理标志产品。雷山银球茶是全国独一无二的特型茶，加工技术获多项国家专利[6]，其表面银灰墨绿，含硒量高达2.00～2.02 μg/g，是一般茶叶平均含硒量的15倍左右，其利用高山茶叶果胶丰富特点，不加任何添加剂，手工制成一种不同于坨茶、砖茶的球状茶，冲4～5次水余香犹浓，茶水微黄清澈，饮之醇香而微甜。茶叶的质量主要涵盖三部分，即感官指标、理化指标和卫生指标。茶叶品质通过感官审评来进行，具有一定的局限性，尤其是对我国国家地理标志保护的原产地茶和各种名茶，说服力不足，不能全面客观地反映茶叶的品质[7-8]。指纹图谱是一种综合、可量化的质量控制手段，近年来在茶叶品质鉴定、真伪鉴别、品种和产地识别等方面的应用越来越广泛[9-12]。由于产地偏远、知名度较弱，目前对雷山银球茶的研究较少，对雷山银球茶的鉴别缺乏有效的方法。雷山银球做为绿茶与其他绿茶具有很高的相似度，不易区分。为此，笔者等应用超高效液相色谱指纹图谱法分析7个雷山银球茶样品，对雷山银球茶中水溶性成分进行测定，并与其他绿茶进行对比分析，以期为雷山银球茶的鉴别和质量控制提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

茶叶样品：7个雷山银球茶(L1～L7)，取自雷山县茶企业； 2个绿茶(Z1，Z2)取自其他茶企业。试验采用的茶叶均为2018年生产，其生产信息见表1。

表1 茶叶样品生产信息

仪器与设备：Waters超高效液相色谱仪[Waters PDA 检测器，色谱柱Waters PEH C18，并配有Waters PEH C18预柱 沃特世科技(上海)有限公司]，数控超声清洗机(上海冠特超声波仪器有限公司)，分散机(德国IKA)，离心机(TG-16-WS 湖南湘仪)，电子天平(JY5002 上海舜宇恒平)，电热恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1检测方法

1) 样品前处理。称取1.000 g粉碎茶样(过40目筛网)于100 mL锥形瓶中，加入90℃的超纯水100 mL，立即放入90℃水浴中超声提取20 min。提取完成后，静置，冷却至室温，4 500 r/min离心5 min后取上层清液，过0.45 μm滤膜，待测。

2) 色谱条件。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×100 mm×1.7 μm)，柱温30℃，进样量：2 μL。检测器：二极管阵列检测器，检测波长210 nm。流动相：溶剂A，0.01%磷酸水溶液，溶剂B：乙腈。洗脱程序见表2。

表2 超高效液相色谱梯度洗脱程序

1.2.2精密度、准确度及空白试剂干扰性根据1.2.1检测方法处理样品6个重复并测定，得到6次重复的目标色谱峰保留时间和峰面积，分别计算其相对标准偏差(RSD)。

1.2.3指纹图谱的构建和相似度评价按照已建立的UPLC分析方法，对7个雷山银球茶样品进样分析，将所提到的雷山银球茶色谱图CDF原始文件导入中药指纹图谱相似度评价系统(2012版)，得到7个雷山银球茶样本的指纹图谱，并进行相似度评价分析。

根据中药指纹图谱相似度评价系统分析，将各色谱峰的保留时间与同一图谱中参照峰的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间；各色谱峰按相对保留时间一一匹配后，选择 90% 以上样本共有的峰为样本集的共有峰[13-14]。

1.2.4水溶性成分分析按照 1.2.1中的方法进行所有茶叶样品前处理得到上机液，再按 1.2.2 色谱条件，进样2 μ L ，连续进样 3 次，通过对照标准品比对，确定化合物。运用外标法根据峰面积平均值，计算各茶叶中已知成分的含量。

1.2.5主成分分析主成分分析是将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量的一种多元统计分析方法[15]。运用SPSS分析软件，将多维变量进行降维处理分析，选出最主要的可代表所分析问题的数据，从而使分析问题简单化。在样品已知成分定量分析的基础上，将茶叶中所含的各化合物的含量作为变量，对雷山银球茶样品进行主成分分析。

1.3数据分析

试验数据处理与标准曲线绘制采用 Excel 2007 进行分析，采用 SPSS 进行主成分聚类分析。

2结果与分析

2.1方法学考察

经测定，6次重复的色谱峰保留时间和峰面积的RSD范围分别是0.26%～1.59%和0.63%～3.12%，表明测定方法的精密度和准确度良好，试剂空白对试验无干扰。

2.2雷山银球茶指纹图谱的构建

从图1可知，7个雷山银球茶的色谱图有27个共有峰。从表3可知，雷山银球茶27个共有峰的平均相对保留时间为0.821～16.006min。 通过对照标准品比对，共确定12种化合物(图2)，分别是表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(ECG)、表儿茶素没食子酸酯(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素(GC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、没食子酸(GA)、咖啡因(CAF)、儿茶素没食子酸酯(CG)、茶氨酸、儿茶素和茶碱。

图1 雷山银球茶 L1～L7样品的指纹图谱

注：峰2为茶氨酸，峰3为GA，峰6为GC，峰7为茶碱，峰9为EGC，峰11为儿茶素，峰12为CAF，峰18为EC，峰19为EGCG，峰21为GCG，峰25为ECG，峰26为CG，其余色谱峰未知。

Note: peak 2, theanine; peak 3, GA; peak 6, GC; peak 7, theophylline; peak 9, EGC; peak 11, catechin; peak 12, CAF; peak 18, EC; peak 19, EGCG; peak 21, GCG; peak 25, ECG; peak 26, CG. The remaining peaks are unknown.

图2雷山银球茶UPLC共有峰指纹图谱

Fig.2 Common peaks from UPLC fingerprints of Leishan Yinqiu tea samples

表3 雷山银球茶共有峰的平均相对保留时间

2.3雷山银球茶UPLC指纹图谱相似度评价

从表4可知，雷山7个银球茶(L1～L7)与对照品指纹图谱相似度(共有模式)在0.964～0.984，均值在0.96以上，相似度较高，可见雷山银球茶的化学成分相似且稳定[16]。2个绿茶(Z1，Z2)与对照品指纹图谱的相似度分别是0.94和0.947，由于同属于绿茶类，生产地也较接近，因此在共有模式下相似度也较高[17]。但是，Z1和Z2与L1～L7的相似度在0.861～0.903，可见，绿茶与雷山银球茶的差别比较明显。

表4 不同茶叶与雷山银球茶UPLC指纹图谱的相似度

2.4不同茶叶水溶性成分含量

从表5可知，L1～L7的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表儿茶素没食子酸酯含量分别是3.9～8.5 mg/g和5.0～8.1 mg/g ，较Z1和 Z2低(11.1～12.0 mg/g和13.9～15.1 mg/g)；L1～L7的茶氨酸为17.2～21.9 mg/g ，比Z1和Z2高(11.8 mg/g和10.3 mg/g)。因此，雷山银球茶与绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯和茶氨酸差别较明显，其余水溶性浸出物含量的差异较小。不同的原料、不同加工方式对茶叶的水溶性浸出物均有影响，由于产地较接近，又同属于绿茶类，故绿茶(Z1，Z2)和雷山银球茶(L1～L7)的部分水溶性浸出物较相似。

表5 不同茶叶水溶性成分含量

2.5雷山银球茶主成分分析

从表6可知，共提取到2个主成分可以概括雷山银球茶91.811%的成分含量信息。从主成分载荷矩阵(表7)可知，没食子儿茶素没食子酸酯、儿茶素、表没食子儿茶素、没食子酸、表儿茶素、儿茶素没食子酸酯在第一主成分上的载荷较大，即与第一主成分的相关系数均较高；其中没食子儿茶素没食子酸酯的载荷最高。其次，表儿茶素没食子酸酯在第二主成分上的载荷绝对值较大，即负相关程度较高；同时茶氨酸在第二主成分上的载荷最大，即相关程度最高。可知，第一主成分为没食子儿茶素没食子酸酯，第二主成分为茶氨酸。

表6 雷山银球茶主成分分析方差贡献率

表7 雷山银球茶水溶性成分的主成分载荷矩阵

3结论与讨论

雷山银球茶是贵州省雷山县的特产，也是中国国家地理标志产品。超高效液相色谱法(UPLC)比HPLC法分离效率更高、分析速度更快、准确率更高，因此试验应用UPLC测定茶叶中的水溶性浸出物，并结合中药指纹图谱相似度评价方法构建雷山银球茶指纹图谱，同时对雷山银球茶及其他绿茶进行相似度评价。结果表明，雷山银球茶拥有 27个共有峰，通过对照标准品比对，共确定12个化合物。雷山银球茶的指纹图谱与对照标准品的相似度(共有模式)在0.96以上；而另外2个生产地较接近的绿茶(Z1，Z2)与雷山银球茶对比相似度在0.861～0.903；各样品的水溶性浸出物中，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯和茶氨酸的含量差异较明显，其余指标区别较小。主成分得分分析表明，雷山银球茶的第一主成分为没食子儿茶素没食子酸酯，第二主成分为茶氨酸。

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是从中国绿茶中提取的一种成份，它是绿茶主要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组分，占绿茶毛重的9%～13%[18]。茶氨酸为白色针状体，易溶于水。具有甜味和鲜爽味，是茶叶的滋味的组分[19]。雷山银球茶(L1-L7)的茶氨酸明显比绿茶(Z1，Z2)高很多，所以雷山银球茶口感较甘甜爽口。

综上所述，运用UPLC法构建雷山银球茶的特征指纹图谱，通过相似度、对照品定量分析、主成分分析等得到了较为理想的结果 ，对雷山银球茶与其他绿茶的鉴别提供了数据支持和参考依据。