飞进强， 张圣洁， 徐绍忠， 赵昶灵

(云南农业大学 农学与生物技术学院， 云南 昆明 650201)

云南丹参(Salviayunnanensis)为多年生的草本植物，是唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia)的代表植物[1]。该药首载于《滇南本草》，其味苦, 性微寒，色赤象火，入心经。具有补心、生血、养心、定志、安神宁心、健忘怔忡、惊悸不寐、生新血、去瘀血、安生胎和落死胎等功效。一味可抵四物之功[2]，为云南习用的丹参药材，广泛分布于我国西南地区[3-4]。云南丹参的主要药用部位为根部，其中的主要化学成分是脂溶性的二萜类和水溶性的酚酸类物质，药效与2015版《中国药典》中的丹参(Salviamiltiorrhiza)类似，都具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦及凉血消痈等作用[5]，主要用于改善缺血再灌注损伤、心脑血管疾病的治疗[6-8]。云南丹参作为云南地方性药材，功效与丹参相同，作为地方药材收载入1974版的《云南省药品标准》[9]。云南丹参在云南地区具有悠久的使用历史，分布广，资源丰富，具有较高的开发利用价值。目前我国对云南丹参的研究主要集中在化学成分和药理活性方面，对种质资源的收集、栽培方式和化学含量之间的关系的研究尚处于空白。在用药习惯上，将山东丹参称为正品丹参，而云南丹参的利用未在药用中进行使用，而对于云南丹参是否能成功代替山东丹参使用也存在争议。钱子刚等[3]的研究发现，云南丹参的总丹参酮类含量比山东丹参略高，总酚酸含量约高1倍，丹参酮ⅡA含量略高；原儿茶醛含量约为山东丹参的3倍。靳鹏博[10]的研究表明，轻度遮阴处理有利于提高丹参中丹酚酸B的含量。为云南丹参的合理栽培、云南丹参替代山东丹参及云南丹参种质资源筛选、优良品种选育和道地药材品质成因的研究提供理论依据，笔者采用高效液相色谱法对不同产地及不同栽培处理丹参的有效成分进行测定，并与山东丹参进行比较。

1材料与方法

1.1试验材料

云南丹参：分别采集于云南个旧、蒙自、沾益和弥勒。山东丹参，采集于山东莒县。采集不同地方的丹参均栽培于云南农业大学后山实验基地，以山东丹参为对照，设置2种栽培处理：露地栽培和40%遮阴栽培。样品信息见表1。

表1 丹参样品采集信息

试剂与仪器：甲醇(色谱纯，由Dima公司生产)，乙腈(色谱纯，由美国fisher公司生产)，超纯水、Cary 60 UV-Vis 紫外可见分光光度计(安捷伦科技中国分公司)，Aglient1260高效液相色谱仪(安捷伦科技中国分公司)，B-220恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)，ZA100R3 电子精密天平(上海赞维衡器有限公司)。对照品：丹参酮Ⅰ(批号：568-73-0)，隐丹参酮(批号：35825-57-1)，丹参酮ⅡA(批号：568-72-9),丹酚酸B(批号：115939-25-8)，由成都克洛玛生物科技有限公司生产。

1.2试验方法

1.2.1供试品溶液的制备把不同种源的样本丹参干燥至恒重，粉碎为细粉，过40目筛。称取0.3 g细粉放置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL甲醇，密塞，精密称定，30℃超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得丹参酮类供试品溶液。称取0.15 g细粉放置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL的80%甲醇，密塞，精密称定，30℃超声处理30 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，移至10 mL量瓶中，加80%甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得丹酚酸B供试品溶液。

1.2.2标准品溶液的制备精密称取标准品丹参酮Ⅰ、隐丹参酮及丹参酮ⅡA标准品，在加入甲醇制备为54 μg/mL、78 μg/mL及230 μg/mL的储备液，滤过，即得丹参酮类物质的标准品。精密称取丹酚酸B标准品适量，加入80%甲醇稀释定容，制备为245 μg/mL的储备液，滤过，即得丹酚酸B的标准品。

1.2.3色谱条件丹参酮类物质色谱条件：检测波长270 nm，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)，流速为1.2 mL/min，柱温25℃。以乙腈为流动相A，以0.02%磷酸为流动相B,梯度洗脱25 min，梯度洗脱0～6 min，A相61%，B相39%；6～20 min，A相61%～90%，B相39%～10%；20～20.5 min，A相90%～61%，B相10%～39%；20.5～25 min，A相61%，B相39%。进样量10 μL。理论板数按丹参酮ⅡA不低于6 000。

丹酚酸B色谱条件：检测波长286 nm，色谱柱为Agilent Exted-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速为1.2 mL/min，柱温30℃。以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸为流动相B，洗脱50 min，梯度洗脱0～15 min，A相17%～23%，B相83%～77%；15～30 min，A相23%～25%，B相77%～75%；30 min～40 min，A相25%～90%，B相75%～10%；40 min～50 min，A相90%，B相10%。进样量10 μL。理论板数按丹酚酸B峰计算不低于6 000。

1.2.4高效液相色谱法考察线性考察:精密吸取各标准品溶液1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL进样，按确定的色谱条件进行分析，以标准品溶液的进样量为横坐标(x)，相对峰面积为纵坐标(y)构建线性回归方程。精密度试验：精密吸取同一样品的溶液，连续进样6次，对各成分进行测定。重复性试验：精密取同一丹参样品，重复6次，制备样品溶液，对各成分进行测定。稳定性试验：精密吸取同一样品溶液10 μL，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和24 h后进样，对各成分进行测定。加样回收率试验：精密称量6份已知含量的样品粉末，分别加入适量的丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹酚酸B的标准品，制备成供试溶液，分别测定丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹酚酸B的含量。加样回收率的计算公式如下：

回收率=(实际测得的含量值-样品中有效含量)/加入标准品的含量×100%

2结果与分析

2.1高效液相色谱法方法学考察结果

从表2可知，丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹酚酸B的线性回归方程的R2分别为1、1、1和0.999 8，线性关系良好。精密度、重复性和稳定性结果显示各成分共有峰相对保留时间的RSD均<3%，各成分相对含量的RSD均<3%，表明该高效仪器的精密性良好，方法重现性较好，有效成分稳定性较好。

丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA和丹酚酸B的加样回收率分别为99.48%、99.92%、99.29%和99.78%。RSD分别为1.20%、0.42%、0.44%和1.26%，表明该测定方法准确度高。

表2 丹参活性成分标准品回归方程

2.2丹参酮类含量

从表3可知，露地环境下，丹参酮Ⅰ含量，以云南沾益的丹参含量最高，为0.112 1%，云南沾益、个旧、蒙自、弥勒的丹参均显著高于山东丹参。隐丹参酮含量，山东丹参的含量最高，显著高于云南个旧、蒙自、沾益、弥勒丹参。丹参酮ⅡA含量，山东丹参的含量最高，显著高于云南沾益、弥勒丹参，与云南个旧、蒙自丹参的含量差异不显著。2015版《中国药典》中规定，干燥品丹参中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的总含量不得低于0.25%，综合看，露地生长环境中各样品均未达到药典的要求。

遮阴环境下，丹参酮Ⅰ含量，云南个旧、蒙自、弥勒的丹参含量均略高于山东丹参，云南沾益丹参酮Ⅰ含量最低，为0.056 8%；云南蒙自丹参酮Ⅰ含量最高，为0.128 8%，与云南沾益、弥勒和山东丹参之间差异显著，与云南个旧的差异不显著。隐丹参酮含量，云南个旧、沾益、蒙自丹参均高于山东丹参，其中，云南蒙自最高，为0.026 2%，云南弥勒丹参最低，为0.007 4%。云南蒙自的隐丹参酮的含量显著高于云南沾益、弥勒，与云南个旧、山东丹参之间差异不显著。丹参酮ⅡA含量，云南蒙自丹参最高，为0.272 9%，显著高于云南沾益、弥勒，与云南个旧和山东丹参之间差异不显著。2015版《中国药典》中规定，干燥品丹参中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的总含量不得低于0.25%，综合来看遮阴生长环境中，云南个旧、蒙自的云南丹参和来自山东的丹参符合2015版《中国药典》的要求。在这5种供试样品中，云南蒙自的丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA总含量最高，为0.427 9%。

2.3丹酚酸B含量

由表4可知，露地环境下，来自云南弥勒的丹酚酸B的含量最高，为4.199 4%，显著高于来云南个旧和蒙自，与云南沾益、蒙自及山东丹参的含量差异不显著。2015版《中国药典》规定，干燥品丹参中丹酚酸B的含量不能低于3.0%，来自云南沾益、蒙自、弥勒的丹参和山东丹参符合该要求。

表3不同产地不同环境丹参的丹参酮类含量

Table 3 Tanshinone content ofS.yunnanensissamples from different producing areas under different growth environment %

产地Producing area丹参酮Ⅰ含量Tanshinone Icontent露地遮阴隐丹参酮含量Cryptotanshinonecontent露地遮阴丹参酮ⅡA含量Tanshinone IIA content露地遮阴3种丹参酮总量Total amount of three tanshinones露地遮阴云南个旧 Gejiu, Yunnan0.091 3 a0.109 4 ab0.007 9 cd0.020 1 ab0.115 2 ab0.235 5 ab0.214 4 a0.365 0 a云南沾益 Zhanyi, Yunnan0.112 1 a0.056 8 b0.011 3 c0.014 5 bc0.093 7 b0.041 2 c0.217 0 a0.112 5 c云南蒙自 Mengzi, Yunnan0.084 2 a0.128 8 a0.007 9 cd0.026 2 a0.124 2 a0.272 9 a0.216 4 a0.427 9 a云南弥勒 Mile, Yunnan0.096 9 a0.092 5 ab0.006 9 d0.007 4 c0.041 9 c0.143 0 bc0.145 7 b0.242 9 b山东莒县 Juxian, Shandong0.031 0 b0.063 0 b0.050 3 a0.013 9 bc0.138 7 a0.241 1 ab0.220 1 a0.318 1 ab

注：表中同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letlers in the same column indicate significant difference atP<0.05.The same below.

表4不同产地不同环境丹参的丹酚酸B含量

Table 4 Salvianolic acid B content ofS.yunnanensissamples from different producing areas under different growth environment %

产地Producing area丹酚酸B含量 Salvianolic acid B content露地遮阴云南个旧 Gejiu, Yunnan1.926 6 c3.334 0 bc云南沾益 Zhanyi, Yunnan3.114 7 abc1.700 0 d云南蒙自 Mengzi, Yunnan3.055 0 abc5.836 2 a云南弥勒 Mile, Yunnan4.199 4 a2.137 6 cd山东莒县 Juxian, Shandong3.790 2 ab4.652 9 ab

遮阴环境下，云南蒙自丹参的丹酚酸B含量最高，为3.005 0%，显著高云南个旧、沾益、弥勒，与山东丹参差异不显著。2015版《中国药典》规定，干燥品丹参中丹酚酸B的含量不能低于3.0%，云南个旧、蒙自的丹参和山东丹参均符合要求。遮阴环境种植的山东丹参及云南个旧、蒙自丹参的丹酚酸B含量显著高于露地环境的。在露地环境种植的云南沾益、弥勒的丹参丹酚酸B含量显著高于遮荫环境的。

3结论与讨论

有效成分含量的高低是对药用植物品质评定的重要标准。2015版《中国药典》规定，丹参类药材脂溶性成分丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮的总含量不低于0.25%，水溶性成分丹酚酸B的含量不低于3%。在脂溶性成分含量方面，露地环境条件下云南丹参和山东丹参的含量均未符合2015版《中国药典》的要求；遮阴环境条件下生长的来自云南个旧、蒙自的丹参和山东丹参都符合药典的要求，其中云南蒙自丹参含量最高，较山东丹参增加34.52%。在水溶性成分含量方面，露地环境条件下，云南沾益、蒙自、弥勒的丹参和山东丹参都符合药典要求，其中云南弥勒的丹参含量最高，较山东丹参增加10.8%；遮阴环境条件下生长的云南个旧、蒙自的丹参和山东丹参都符合药典要求，其中云南蒙自丹参的含量最高，较山东丹参增加25.43%。

综合看，在品质方面，最好的是云南蒙自丹参，其脂溶性成分丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮的总含量和水溶性成分丹酚酸B的含量均符合《中国药典》2015版的要求。这与文凤娟[11]得出的产自云南蒙自的丹参是比较优质的研究结果一致 。

研究发现，遮阴环境条件较露地种植更有利于丹参有效成分含量的积累，王自力等[12]研究发现，进行果树和药用植物套种，不仅可以在夏季时降低地表温度和减少土壤水分散失，而且药用植物还能压制杂草，改善果园小环境。邹平洲等[13]研究发现，林下栽培和果树套种可提高土地空间利用率、增加土地效益，这对现代农林的发展具有重要意义。因此，可以考虑将云南丹参和山东丹参进行林下种植或与果树等进行套作，增加有效成分积累的同时增加经济效益。

研究表明，来自云南蒙自的云南丹参品质最好，在云南地区可以替代山东丹参种植与使用。在生产中可以将云南丹参进行合理的遮阴，以生产出优质、符合国家药典规定的丹参药材。