保元汤颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定

2019-10-08袁玲玲钱如贵丁丽娜李心锋

云南中医中药杂志 2019年8期

关键词：甘草

袁玲玲钱如贵丁丽娜李心锋

摘要：目的建立HPLC法测定保元汤颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。方法根据《中国药典》规定的方法，并加以优化，以Agilent Eclipse plus（5μm，4.6 mm × 250 mm）为色谱柱，以乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～20min，15%～40%A;20～25min，40%A），流速1.0 mL/min，柱温25℃，检测波长260nm。结果经方法学验证，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在25.23～504.5ng（R2=0.9995）范围内线性关系良好，该检测方法专属性较好，阴性无干扰，精密度RSD为0.26%，重复性RSD为3.98%，中间精密度RSD为3.12%，加样回收率为93.63%（RSD为3.98%），溶液稳定性在8h以内可保持稳定（RSD为1.47%），该方法耐用性较好。经测定，甘草中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为0.0045～0.0161%，保元汤颗粒（含有辅料，6 g/袋）中为87.98～97.46μg·g-1。结论本研究所建立的方法简便，结果准确可靠，适用于保元汤颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的测定，为建立保元汤质量标准提供依据。此外，本研究首次对甘草中毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行了鉴别及含量测定，为甘草及其制剂质量标准深入研究奠定基础。

关键词：保元汤颗粒;毛蕊异黄酮葡萄糖苷;甘草;HPLC法

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2019）08-0069-07

【Abstract】Objective： To establish a HPLC method for the determination of calycosin isoflavone glucoside in Baoyuantang granules. Methods： According to the method specified in the Chinese Pharmacopoeia， Agilent Eclipse plus （5μm， 4.6 mm×250 mm） was taken as chromatographic column and acetonitrile （A）-0.2% formic acid solution （B） as mobile phase， with gradient elution （0～20min， 15%～40%A; 20～25min， 40%A）， flow rate 1.0 mL/min， column temperature 25℃， and detection wavelength 260 nm. Results： The method showed that calycosin isoflavone glucoside had a good linear relationship in the range of 25.23 to 504.5ng （R2=0.9995）. The detection method had good specificity and no interference. The precision RSD was 0.26% and the reproducible RSD was 3.98%， and the intermediate precision RSD is 3.12%. The sample recovery rate was 93.63% （RSD is 3.98%）， and the solution stability could be kept stable within 8h （RSD is 1.47%）. The method had better durability. The content of calycosin isoflavone glucoside in the licorice was determined to be 0.0045-0.0161%， and that in the Baoyuantang granules （containing excipients， 6 g/bag） was 87.98～97.46μg·g-1. Conclusion： The method established in this study is simple， accurate and reliable and suitable for the determination of calycosin isoflavone glucoside in the Baoyuantang granules， and provides a basis for establishing the quality standard of Baoyuantang. In addition， the study was the first to identify and determine the content of calycosin isoflavone glucosides in licorice and lay a foundation for further research on the quality standards of licorice and its preparations.

【Key words】Baoyuantang granules， calycosin flavonoid glucoside， licorice， HPLC method

保元湯为治疗元气虚弱的古代经典方剂，最早见于明代魏直的《博爱心鉴》，将其作为治疗小儿痘疮的基础方，由人参、黄芪、肉桂、甘草四味药物组成，全方可大补元气，尤补后天脾肺之气，健脾保肺温肾，能治一切元气虚弱之证，故名“保元”[1]。明代孙志宏所著《简明医彀》中记载保元汤“由人参一钱，黄芪二钱，甘草五分，肉桂二分组成，右加生姜一片，水煎服。治元气虚弱，精神倦怠，肌肉柔慢，饮食少进，面青白，睡卧宁静，及有杂证，皆属虚弱，宜服。”药理研究发现，该方具有调节免疫、促进心血管功能、促进造血、调节凝血及纤溶平衡、抗氧化、抗应激等多种药理作用，与其补气温阳的功能相吻合。临床上广泛用于气虚、免疫失调引起的多种疾病[2，3]。

人参和黄芪作为该方的君臣药，各活性成分均起到重要的药理作用[4]，其中，毛蕊异黄酮葡萄糖苷是黄芪中具有代表性的黄酮类成分之一，具有抗病毒、抗菌、降脂、抗氧自由基、抗缺血、抗骨质疏松、促血管新生等作用[5，6]，该成分可作为保元汤颗粒的质量控制指标。研究中发现，黄芪和甘草均含有毛蕊异黄酮苷葡萄糖苷，其中甘草中含量较低，通过本研究建立保元汤颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定方法，并对其进行方法学验证研究，为保元汤颗粒质量标准建立提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 试验材料保元汤颗粒（昆明邦宇制药有限公司，自制，6 g/袋）;毛蕊异黄酮葡萄糖苷（中国食品药品检定研究院，111920-201606）;甲醇（国药集团化学试剂有限公司，20181102）;三氯甲烷（国药集团化学试剂有限公司，20180223）;甲酸（天津风船化学试剂科技有限公司，20100722）;乙腈（Fisher Chemical，177798），硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工厂分厂，20130708）。

1.2 试验仪器 ME204电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）;BT125D电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）;Aglient 1260高效液相色谱仪（Agilent Technologies Inc.，G1311C 1260 Quat pump四元泵，G1329B自动进样器，G1316A 1260TCC柱温箱，G1314F 1260VWD紫外检测器）;SK250LH7超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）;HH-S26数显双列六孔恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 保元汤颗粒制备根据《简明医彀》记载和明代衡制单位，换算为现代质量单位的处方见表1。

取以上五味药材，人参、肉桂破碎为细块或粗粉，生姜切成薄片，黄芪、甘草取饮片，加20倍纯化水分3次提取，每次煮沸30 min，合并提取液，过滤，浓缩，干燥，提取得率为21.42～24.82%，加入适量辅料，制成颗粒。包装规格：6 g/袋;用法用量：每天2次，每次1袋。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品约10 mg，精密称定，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为1 mg·mL-1 的对照品储备液。精密量取储备液5 mL，置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得50 μg·mL-1对照品溶液，置2～8℃冰箱中保存备用。

2.2.2 黄芪药材供试品溶液制备取黄芪药材粉末1.0 g，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流4h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤25 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得[7]。

2.2.3 甘草药材供试品溶液制备称取甘草药材粉末5.0 g，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇70 mL，称定重量，加热回流4h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤35 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 保元汤黄芪、甘草双阴性供试品溶液制备按处方量称取人参、肉桂、生姜各适量，依照2.2.2 供试品溶液的处理方法处理。

2.2.5 保元汤颗粒供试品溶液取保元汤颗粒1袋，研细，称取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇30 mL，超声处理（功率180W，频率53kHz）30 min，滤过，滤渣同法再处理一次，合并滤液，蒸至近干，残渣加甲醇适量溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件优化按2.2.5制备供试品溶液，参考文献[8]及中国药典黄芪药材项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法进行，出峰时间在5.9 min，附近峰比较密集，容易受溶剂干扰影响，后将流动相比例加以调整，出峰时间延后至8.9 min，分离度和理论塔板数均得到改善，改善后的毛蕊异黄酮葡萄糖苷成分与其他成分分离度良好，分离度大于1.5，符合药典要求。流动相比例调整情况及结果详见表2，调整前后HPLC图谱见图1。

根据实验结果，得到优化的色谱条件，色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱，0～20 min，15%～40%A;20～25min，40%A，流速：1.0 mL·min-1，柱温：25℃，检测波长260 nm，进样量：10μL。保留时间为20min，理论塔板数以毛蕊异黄酮葡萄糖苷计不低于3000。

2.4 方法學验证

2.4.1 专属性考察

2.4.1.1 HPLC检测分别吸取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液、黄芪药材供试品溶液、甘草药材供试品溶液、保元汤黄芪甘草双阴性供试品溶液、保元汤颗粒供试品溶液10 μL，依2.3方法检测。结果表明，保元汤颗粒、黄芪、甘草tR8.9 min均有吸收峰，通过改变流动相比例和流速，该峰依然重合，而保元汤黄芪、甘草双阴性供试品溶液无干扰，说明黄芪、甘草中均含有毛蕊异黄酮葡萄糖苷，保元汤颗粒中含有的毛蕊异黄酮葡萄糖苷来源于黄芪和甘草，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为保元汤颗粒质量控制成分具有较好专属性。专属性实验HPLC图谱见图2。

2.4.1.2 TLC鉴别吸取各供试品溶液及毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液（浓度为0.3 mg·mL-1）各10 μL，分别点样于同一硅胶GF254 薄层板上，用三氯甲烷-甲醇-水（13∶ 7∶ 2）的下层溶液为展开剂，展开后，晾干，置紫外光灯254 nm下观察[9]。保元汤颗粒、黄芪、甘草供试品溶液与对照品溶液在相应位置上显示相同颜色的斑点，但保元汤黄芪、甘草双阴性供试品溶液无相应斑点，与HPLC检测结果一致，由此确定，同为豆科植物的黄芪和甘草两种药材均含有毛蕊异黄酮葡萄糖苷。TLC图谱见图3。

2.4.2 线性及范围考察分别精密吸取混合对照品溶液适量，依次稀释成2.5、5.0、10、20、30、40、50 μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入液相色谱仪，按2.3色谱条件进行分析，测定峰面积，以峰面积积分值作为纵坐标（Y），毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样量作为横坐标（X），绘制标准曲线，得到回归方程Y=2496.2X+12.915，R2=0.9995，表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷在25.23～504.5 ng范围内，进样量（ng）与峰面积（mAU）呈良好线性关系。线性关系数据见表3，标准曲线见图4。

2.4.3 精密度考察精密吸取40 μg·mL-1的对照品溶液10 μL，重复进样6次，记录峰面积。经计算，毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD为0.26%，符合RSD≤2.0%的要求，表明该方法精密度良好。相关数据见表4。

2.4.4 重复性考察取保元汤颗粒，按2.2.5项下平行制备6份供试品溶液，依法测定，结果6份供试品溶液含量依次为：93.861、95.871、93.213、93.865、93.787、85.363 μg·g-1，平均含量为92.660 μg·g-1，RSD为3.98%，符合待测成分含量为0.01%时重复性RSD≤4.0%的要求，表明方法重复性良好。相关数据见表5。

2.4.5 中间精密度考察不同人在不同时间进行操作，取保元汤颗粒，按2.2.5项下平行制备6份供试品溶液，依法测定，结果6份供试品溶液含量依次为：89.829、89.499、93.170、92.749、91.761、95.022 μg·g-1，平均含量为92.005 μg·g-1，RSD为2.28%，与2.4.4中测定结果92.660 μg·g-1比较，平均含量为92.33 μg·g-1，RSD为3.12%，符合RSD≤4.0%的要求，表明方法中间精密度较好。相关数据见表5。

2.4.6 准确度（加样回收）考察称取保元汤颗粒粉末9份，每份约1.0 g，精密称定，分成3组，分别按已知质量分数的50%、100%、150% 3个水平加入毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液（50.45 μg·mL-1）1、2、3 mL，按“2.2.5”项下方法制备，依法测定，计算回收率。毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均回收率为93.63%，符合待测成分含量为0.01%时回收率范围达到85～110%的要求，回收率的RSD为3.98%，符合RSD≤4.0%的要求。保元汤颗粒中的原有量按2.4.5中计算的结果92.3μg·g-1计算而得，相关数据见表6。

2.4.7 稳定性试验吸取同一供试品溶液（室温放置）各10μL，分別于0、2、4、8、12、24 h进样测定，比较峰面积变化，结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷供试品溶液在8h以内均能保持稳定，各时间点峰面积比较，RSD为1.47%，在24 h内溶液稳定性稍差，各时间点峰面积比较，RSD为2.06%。相关数据见表7。

2.4.8 耐用性试验在各色谱条件下，称取同一批次保元汤颗粒（批号20181220），按2.2.5项下制备供试品溶液，依改变色谱条件相关参数及色谱柱，详细参数变化及结果见表8，改变各条件测定结果与原条件比较，理论塔板数与分离度均能达到要求，与原条件比较相对平均偏差依次为1.84%、0.34%、0.63%、1.59%，均达到RAD≤2.0%的要求，另外各条件下结果比较RSD为1.60%，说明该方法耐用性较好。

2.5 毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定

2.5.1 甘草中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定由2.4.1中专属性考察结果可知，甘草与黄芪均含有毛蕊异黄酮葡萄糖苷。取市售4个不同生产商/供应商的甘草（饮片），测定其含量。称取各批次甘草粉末5.0 g，按2.2.3方法处理样品，结果见表9。各甘草药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量差异大，其中1#为制备保元汤颗粒所用批次甘草，含量为0.0080%，四个样品中内蒙古所产的甘草含量最高，达到0.0161%。

2.5.2 黄芪含量测定取制备保元汤颗粒所用批次的黄芪药材，按2.2.2制备供试品溶液，依法检测，计算含量为0.0687%。

2.5.2 保元汤颗粒含量测定称取保元汤颗粒，按2.2.5项下制备供试品溶液，依法测定，按外标法计算样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量，结果见表10。三个批次保元汤颗粒含量在87.98～97.46 μg·g-1范围内。

3 结论与讨论

中医的“虚症”，指人体正气不足，脏腑功能减弱或衰退所表现的证候，包括免疫力低下、易生病、久病不愈等，中医以扶正固本作为治病的基本法则。而正气的盛衰是一个动态的传变过程，不仅与各脏腑及气、血、精、液的状态密切相关，也与环境的变化有着紧密的联系[10]。保元汤颗粒用于治疗元气虚弱、精神倦怠、肌肉柔慢等虚症，通过调节五脏六腑气血的阴阳平衡来改善患者的免疫功能，提高患者的免疫力水平[11，12]。作为保元汤方中的臣药，黄芪用以补气，药用历史悠久，黄芪的化学成分主要有黄酮类、皂苷类等成分，其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷是黄芪中主要成分之一，也是药典中收录黄芪的质量控制指标之一，不仅具有抗氧化活性、抗炎、免疫抑制的作用，还可以抑制病毒复制，改善心脏功能，调节细胞免疫、体液免疫功能[13，14，15]。这些药理作用都与改善机体脏腑功能、改善虚证有关，该质量控制指标的建立具有实际意义。

气血津液互根互用，共同发挥保护机体驱邪抗病的作用。若脾胃健运，气血津液充盈，正气充足，免疫功能多正常，则不易被病原微生物等邪气侵袭;若脾虚气血津液亏虚，正气不足，免疫功能多缺陷或低下，则难以抵抗邪气侵袭而患病[16]。

作为方中的使药，甘草含有多种活性成分，其中，甘草酸、甘草苷为药典中规定的甘草质量控制指标，已有大量文献报道了甘草中甘草酸、甘草苷的含量测定方法，但是，没有关于甘草中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定的文献报道。本研究首次对甘草中毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行了鉴别及含量测定，这也为甘草药材及含甘草中药复方制剂的质量标准制定提供了参考依据。甘草、黄芪同为豆科植物，均含有毛蕊异黄酮葡萄糖苷，其它豆科类植物药材中是否含有该成分，有待深入研究。

根据实验结果，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在药材黄芪中含量为0.0687%、甘草为0.0080%，3批保元汤颗粒含量为87.98～97.46 μg·g-1。保元汤颗粒（含有辅料）每袋6 g，每袋相当于含有黄芪3 g，甘草0.75 g，若毛蕊异黄酮葡萄糖苷成分转移率为100%，保元汤颗粒应含毛蕊异黄酮葡萄糖苷353.5 μg·g-1，但实际转移率仅为24.89～27.57%。本次实验中，按照古籍文献记载的传统水煎煮方法制备保元汤颗粒，由于毛蕊异黄酮葡萄糖苷易受热脱去葡萄糖转变为毛蕊异黄酮[17，18]，成分转移率会受到较大影响，但作为具有生物活性且专属于黄芪和甘草的成分之一，仍然可作为含量控制指标。经方法学验证，本研究建立保元汤中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法，专属性较好，阴性无干扰，分离度能达到要求，重复性、中间精密度、耐用性等均符合要求，方法简便，可操作性强，可用于保元汤颗粒的质量控制。

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