李鹏飞 杨季国 吴慧芬 林之涵 岑婵琳 闫姬雪

[摘要] 目的 研究平喘I号调节基质细胞衍生因子-1（SDF-1）及其受体CXCR4在支气管哮喘小鼠肺内表达变化及影响。 方法 72只雌性BALB/C小鼠按数字随机分为正常对照组、模型对照组、布地奈德组、平喘I号低剂量组、中剂量组、高剂量组，共6组，每组12只。通过卵清蛋白（OVA）致敏和激发复制支气管小鼠哮喘模型，然后分别予生理盐水、布地奈德药物及中药平喘I号低、中、高剂量干预。取小鼠肺组织，通过病理切片观察，图像分析软件测定支气管壁厚度（Wat）和平滑肌厚度（Wam），采用实时定量PCR测定小鼠肺组织中SDF-1 mRNA及CXCR4 mRNA的含量，通过免疫印迹法检测肺组织中SDF-1及CXCR4的蛋白表达水平，采用线性相关分析技术测量了SDF-1与CXCR4的相关性。 结果 SDF-1及CXCR4的表达水平在正常对照组中较低，在模型对照组中表达水平明显增高（P均<0.01）。与模型对照组比较，平喘I号各剂量组和布地奈德组中SDF-1及CXCR4的表达水平均明显降低（P<0.01或P<0.05）;其中布地奈德組表达水平低于平喘I号低剂量和中剂量组（P<0.05或P<0.01），而中药高剂量组的表达水平低于布地奈德组（P<0.05）。 结论 在支气管哮喘气道炎症及其气道重塑过程中，SDF-1及其受体CXCR4两者相互作用，干预其重塑过程。平喘I号通过影响SDF-1及CXCR4在肺内的表达而干预哮喘气道重塑，达到缓解哮喘症状的作用。

[关键词] 支气管哮喘;气道重塑;平喘I号;基质细胞衍生因子-1;CXC趋化因子受体4

[中图分类号] R562.25          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）21-0043-04

Effect of Pingchuan Ⅰ on the expression of SDF-1 and CXCR4 in airway remodeling in asthmatic mice

LI Pengfei   YANG Jiguo   WU Huifen   LIN Zhihan  CEN Chanlin   YAN Jixue

Department of Traditional Chinese Medicine Pediatrics， Hangzhou Xiaoshan District Hospital， Hangzhou   310053， China

[Abstract] Objective To study the influence of Pingchuan Ⅰ in regulating stromal cell-derived factor-1 （SDF-1） expression and its receptor CXCR4 in the lung of bronchial asthma mice. Methods 72 female BALB/C mice were randomly divided into normal control group， model control group， budesonide group， Pingchuan Ⅰ low-dose group， middle-dose group and high-dose group. There were 12 mice in each group. The bronchial mouse asthma model was copied by ovalbumin （OVA） sensitization and stimulation， and then administered with normal saline， budesonide and low， medium and high doses of Chinese medicine Pingchuan Ⅰ. Mouse lung tissues were taken and observed by pathological sections. Image analysis software was used to measure bronchial wall thickness （Wat） and smooth muscle thickness （Wam）. Real-time quantitative PCR was used to determine SDF-1 mRNA and CXCR4 mRNA in mouse lung tissues. The expression levels of SDF-1 and CXCR4 in lung tissue were detected by Western blotting. The correlation between SDF-1 and CXCR4 was measured by linear correlation analysis. Results The expression levels of SDF-1 and CXCR4 were low in the normal control group， and the expression levels in the model control group were significantly higher （P<0.01）. Compared with those of the model control group， the expression levels of SDF-1 and CXCR4 in the Pingchuan I each dose group and the budesonide group were significantly lower（P<0.01 or P<0.05）. The expression level in budesonide group was lower than that in the low-dose and medium-dose Pingchuan Ⅰ group （P<0.05 or P<0.01）. While the expression level of the high dose Chinese medicine group was lower than that of the budesonide group（P<0.05）. Conclusion In the process of airway inflammation and airway remodeling in bronchial asthma， SDF-1 and its receptor CXCR4 are involved in the remodeling process. Pingchuan Ⅰ interferes with airway remodeling in asthma by affecting the expression of SDF-1 and CXCR4 in the lungs， to relieve the symptoms of asthma.

[Key words] Bronchial asthma; Airway remodeling; Pingchuan Ⅰ; Stromal cell-derived factor-1; CXC chemokine receptor 4

支气管哮喘（Asthma）简称哮喘，是由IgE介导的呼吸道变态反应性疾病，由多种炎症细胞及细胞因子参与的慢性炎症，通过反复发作与刺激，导致可逆性气道阻塞性疾病，是儿科临床中常见的呼吸道疾病。目前研究阶段，哮喘病理特征是气道高反应性和气道重塑，其中具体发作机制并未完全阐明。现阶段雾化药物中吸入型的糖皮质激素是作为控制及防治哮喘气道重塑的首选药物，但是低剂量的糖皮质激素却不能拮抗气道重塑，同时患儿长期、大剂量的使用皮质激素可引起不同程度的全身副作用。本实验中使用的平喘I号汤剂是杨季国教授在临床多年总结出的治疗哮喘急性发作的方剂，该方剂经过配伍在哮喘的急性发作中有较为明显的效果。在趋化因子家族中的基质细胞衍生因子-1（SDF-1）和CXC趋化因子受体4（CXCR4）两者相互作用，可能通过影响气道炎症及气道血管生成参与了支气管哮喘及气道重塑。本实验通过观察小鼠哮喘模型肺组织中SDF-1 及CXCR4表达的变化，进一步深入明确哮喘发作机制。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选择由浙江中医药大学动物实验室中心提供的BALB/C雌性小鼠72只，4～6周龄，体重（14±2）g。卵清蛋白（OVA）（型号：A5503）：由美国Sigma公司提供;小鼠单克隆SDF-1抗体（产品编号：sc-74271）和小鼠单克隆CXCR4抗体（产品编号：sc-53534）：购于美国Santa cruz 公司。吸入用布地奈德混悬液：购于阿斯利康公司;RNA抽提试剂（TRIzol）：购于美国Invitrogen公司;病理图像分析仪（DMR+Q550）：购于德国LEICA公司。

1.2 方法

1.2.1 致敏液和激发液  致敏液配置：在清洁小烧杯中加入0.15 mL的生理盐水，同时加入40 μgOVA，充分搅拌混合，然后取4%氢氧化铝凝胶溶液2 mg（0.05 mL）与上述混合液体搅拌混合，充分搅拌30 min，从而得到0.2 mL的OVA-氢氧化铝混悬液。激发液：1%OVA雾化液，由OVA与生理盐水成比例混合搅拌溶解，制成含有1%OVA雾化液，现配现用。

1.2.2 平喘I号中药复方的制备  汤剂平喘Ⅰ号是由炒黄芩10 g、竹沥半夏10 g、旋复花10 g、葶苈子10 g、代赭石20 g、苏子10 g、白芥子10 g、杠板归10 g、地龙10 g组成，颗粒剂由药房配置，加水直接搅拌溶解。

1.2.3 动物分组及其模型制作方法  所有小鼠随机分为6组，分别为平喘Ⅰ号低、中、高剂量组、正常对照组、模型对照组、布地奈德对照组，每组12只。根据文献[1-2]，除正常对照组外，其余5组小鼠分别在实验时间第1天、第8天、第15天用注射器在小鼠腹腔注射OVA-氢氧化铝混悬液0.2 mL致敏液，正常对照组注射同等剂量的生理盐水为对照。从第20天开始，正常对照组吸入生理盐水，其他组吸入1%OVA雾化液，隔天1次，每次40 min，共6周。

给药方法：每次雾化前30 min，中药组分别以10 g/（kg·d）、50 g/（kg·d）、100 g/（kg·d）的浓度予低、中、高剂量组灌胃，西药组雾化吸入布地奈德雾化液，正常对照组及模型对照组予生理盐水灌胃。各组小鼠末次激发24 h内腹腔注射戊巴比妥钠45 mg/kg麻醉后处死，在小鼠胸腔部位切开取出右肺叶，同时将肺叶由10%中性甲醛固定，按照常规脱水，采用石蜡包埋，最后进行HE染色，所得到的切片用于病理学组织观察。同时将剩余的肺叶放入液氮冻存以备后续检查。

1.2.4 HE染色  小鼠肺组织石蜡切片，常规脱水，然后苏木精伊红染色，脱水封片。参考文献[2]关于气道各层的定义，采用图像分析软件，对肺内支气管基底膜周径（Pbm）、肺内支气管总的面积（Wat1）、支气管管腔内面积（Wat2）、平滑肌内缘内气管面积（Wam2）、平滑肌外缘内气管面积（Wam1）进行测量后，分别以（Wam1- Wam2）/Pbm和（Wat1-Wat2）/Pbm来表示Wam和Wat。

1.2.5 RT-PCR  将存储于液氮中的肺组织提取100 mg，提取RNA，实验采用TRIzo法，并将其反转录成cDNA。小鼠SDF-1引物：上游5-ACCCTTGGTCTCAA-CATTCC-3，下游5-GCCTTGCCCTCTATCCTTCT-3，擴增长度为183 bp;CXCR4引物：上游5-GGCA-ATGGGTTGGTAATC-3，下游5-GACAATGGCAA-GGTAGCG-3，扩增长度为187 bp;内参β-actin，上游 5-TCCGGTGTTAGGATATGACT-3，下游 5-TGTGCCTGCAACAGGAGTCGG-3扩增的长度为283 bp。记录其反应过程：在实时定量PCR仪上，按操作进行实时定量PCR。最终记录数据并分析的软件采用ABI Prism 7000 SDS软件。Real-time PCR检测的各组目的基因相对于内参β-actin的扩增效率，采用2^-△△Ct法，△△Ct=△Ct-△Ct（average）。

1.2.6 Western Blot检测SDF-1和CXCR4的表达  在冰浴条件下从组织标本中提取细胞总蛋白，并调整蛋白浓度及测定蛋白质含量。一抗：小鼠单克隆SDF-1和CXCR4抗体，稀释度为1：2000，将蛋白样本加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳、转膜及封闭。然后用辣根过氧化物酶（HRP）标记过的二抗孵育洗涤、曝光、显影、定影。最后使用其分析软件，分析SDF-1和CXCR4光密度值，以β-actin为内参，标准化SDF-1和CXCR4的光密度值。

1.3 统计学处理

实验完成后数据分析采用SPSS17.0软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，行方差齐性检验，P<0.05为差异有统计学意义。两组之间样本均数互相比较采用LSD检验，如果方差不齐者用Dunnett，T3检验，两个变量的相关分析采用直线相关法。

2 结果

2.1 病理组织学改变

实验中观察正常对照组，可以看到小鼠肺组织支气管壁结构较为完整，无炎症反应及细胞浸润等改变（封三图6）。相比较之下，在高倍镜中对模型对照组观察中发现，小鼠支气管黏膜上皮细胞大片坏死，部分上皮呈乳头状增生，并伴有管壁周围炎性细胞浸润，气道壁及平滑肌层明显增厚，管腔狭窄（封三图7）。西药布地奈德雾化治疗组炎症反应明显减轻，炎症细胞浸润减少，气道黏膜相对较为完整（封三图8），其中平喘I号高剂量组在支气管上皮及炎性细胞浸润方面较布地奈德组改善更为明显（封三图9）。

2.2 实验各组Wat与Wam的比较

各中药组和布地奈德组较正常对照组可见明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），各治疗组较模型对照组降低（P<0.01或P<0.05），其中中药高剂量组明显低于布地奈德组（P<0.05）。见表1。

2.3 各组小鼠RT-PCR结果

实验结果表明，SDF-1与CXCR4的表达相较正常对照组，在模型对照组中明显增多（P<0.01）。经过中药治疗组和布地奈德组治疗后的表达显著降低（P<0.01或P<0.05），其中布地奈德组与平喘I号的高剂量组相比较效果明显（P<0.05）。见表2。

2.4 各组小鼠SDF-1和CXCR4蛋白的表达

Western Blot 结果提示，模型对照组相比正常对照组可见明显的蛋白表达（P<0.01），各治疗组相对于模型对照组明显降低（P<0.01），其中平喘I号高剂量组的表达低于布地奈德治疗组（P<0.05）。见表3。

2.5 相关性分析

小鼠肺组织中SDF-1蛋白的表达与Wat呈正相关性，其相关系数（r=0.843，P<0.05），小鼠CXCR4蛋白的表达与Wat呈正相关性，其相关系数（r=0.791，P<0.05），在SDF-1mRNA的表达量和SDF-1蛋白水平的表达相关性分析显示，两者呈正相关（r=0.896，P<0.05）。

3 讨论

支气管哮喘是由多种细胞因子、各种炎症细胞参与的一种气道变态反应性疾病[3]，支气管哮喘的主要特征是气道重塑[4]，其发病的关键环节[5]就是气道高反应性和气流受限。近年研究发现，SDF-1/CXCR4[6]在支气管哮喘气道炎症及气道高反应性中起着重要作用。本实验通过建立支气管哮喘小鼠的气道模型[7]，更进一步观察SDF-1/CXCR4在支气管哮喘气道重塑[8]中的作用。

本实验的小鼠通过腹腔注射OVA-氢氧化铝的混合液致敏，然后雾化吸入OVA激发小鼠后，小鼠出现呼吸急促、鼻翼煽动、烦躁不安等症状，通过测量模型对照组中支气管壁厚度和平滑肌厚度的变化，与正常对照组比较差异有统计学意义，从而得知哮喘小鼠模型是成功的。

基质细胞衍生因子（SDF-1）[9]，又被称作CXCL12，属于CXC趋化因子家族，在哮喘的发病过程中发挥了重要作用[10]。在目前已知的T淋巴细胞趋化物质中，SDF-1是最强的一种，主要作用部位在单核细胞、T细胞和CD34+骨髓前体细胞，对单核细胞、嗜酸性粒细胞等均有很强的趋化作用，同时能增强上皮细胞的吞噬功能[11]，因此SDF-1在支气管气道炎症中通过对T细胞的趋化作用参与其中。在支气管哮喘气道重塑过程中，嗜酸性粒细胞在其中发挥重要作用，而SDF-1又介导了嗜酸性粒细胞的趋化作用，可以看出在哮喘的起始免疫应答过程中，SDF-1起到非常关键的作用。同时参考文献Hoshino M[12]的研究发现，在支气管哮喘患者中气道黏膜下血管增多，而肺组织中SDF-1阳性细胞的表达数明显增加，说明两者的发生呈正相关，且其细胞数的增加与支气管气道口径呈负相关。从而得知，SDF-1的变化在支气管气道重塑及其气道炎症中发挥着重要作用。

CXC趋化因子受体4（CXCR4）是SDF-1的特异性受体，由352个氨基酸组成，是7次跨膜[13]表达于不同类型细胞上的蛋白受体，主要表达于各种造血细胞、大部分T淋巴细胞、所有的B淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞，同时在人体的大部分组织中有构成性表达[14]。CXCR4是SDF-1的唯一受體[15]，同时SDF-1也是CXCR4的唯一配体[16]，两者具有高度的亲和力，相互作用，在组织与组织、细胞与细胞之间通过SDF-1/CXCR4轴[17]进行信息传递，从而对气道的慢性炎症反应起着至关重要的作用，进一步参与了机体的各种病理生理过程[18]，对于我们从支气管气道炎症和气道重塑方向研究支气管哮喘提供了重要证据。

在目前的研究中，雾化吸入性的糖皮质激素对于支气管哮喘的治疗以及缓解患儿的生活质量有较为显著的作用，本次研究中，布地奈德组抗炎作用强，对于支气管壁厚度[19]及其黏膜的水肿缓解方面有着显著效果，但我们在实际工作中会碰到家长对使用激素的担心，同时长时间使用糖皮质激素也会带来一些全身性不良反应。目前中医中药给我们研究哮喘提供了新的方向。

平喘I号是通过长期在临床经验中总结出的一组对小儿哮喘有明确疗效的方剂。本研究中服用平喘I号方剂与雾化吸入布地奈德比较，其SDF-1及CXCR4的蛋白[20]和mRNA的表达较哮喘模型组均有下降，同时平喘I号高剂量组在控制气道炎症和缓解气道重塑方面优于布地奈德组，其机制可能与降低SDF-1及CXCR4的表达有关。因此我们应在本次研究基础上进一步深化，为中医中药治疗哮喘提供更多的科学依据。

[参考文献]

[1] Du Q，Chen Z，Zhou LF，et al. Inhibitqry effects of astraga loside Ⅳ on ovalbum in induced chronic experi-mental asthma[J]. Can JPhysiol. Pharmacol，2008，86（7）：449-457.

[2] Kristina Rydell-Tormanen，Lena Uller，Jonas S Eriefalt. Remodeling of exrta-bronchial lung vasculature following allergic airway inflammation[J]. Respir Res，2008，9（18）：105-197.

[3] 尹义平，郭光云，杨力，等. 哮喘小鼠肺组织中SDF-1的表达及意义[J]. 现代中西医结合杂志，2013，31（22）：3424-3426.

[4] 戚好文. 哮喘气道重建支气管哮喘研究中所面临的挑战[J]. 第四军医大学学报，2002，23（13）：1153-1154.

[5] Negrete-Garcia MC，Velazquez JR，Popoca-Coyotl A，et al. Chemokine（C-X-C motif） ligand 12/stromal cell-derived factor-1 is associated with leukocyte recruitment in asthma[J]. Chest，2010，138（1）：100-106.

[6] 王利霞. SDF-1及其受体CXCR4在哮喘大鼠肺组织中的表达及AMD3100的干预作用[D]. 郑州大学，2011.

[7] llanafusa H，Totii S，Yasunaga T，et al. Sproutyland sprouty2 provide a contral mechani-Sm for the Ras/MAPK signaling pathway[J]. Nat cell Biol，2002，4（11）：850-858.

[8] 李昌崇，管小俊，张维溪，等. ERK信号转导途径在哮喘人鼠气道重塑中作用及糖皮质激素的调控[J]. 中华儿科杂志，2007，45（4）：288-292.

[9] Fei X，Zhang X，Zhang G，et al. Cordycepin inhibits airway remodeling in a rat model of chronic asthma[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy，2017，88（5）：335-341.

[10] James Al，Wenzwl S. Clinjcal relevance of airway remodeling in airway diseases[J]. Eur Respir，2007，30（1）：134-155.

[11] 齊晨，彭静静，张淡宜，等. 小GTP酶Rac1对肺癌A549细胞凋亡和吞噬作用的影响[J]. 江苏大学学报（医学版），2017，27（2）：93-97.

[12] Hoshino M，Aoike N，Takahashi M，et al. Increased immunoreactivity of stromal cell-derived factor-1 and angiogenesis in asthma[J]. European Respiratory Journal，2003，21（5）：804-809.

[13] 冯帅南，王莎莉，黄宏. CXC趋化因子受体4的研究进展[J]. 医学综述，2009，15（8）：1124-1126.

[14] 栾斌，黄先杰，乔俊英. SDF-1及CXCR4在哮喘小鼠肺组织中的表达及布地奈德的干预作用[J]. 中国当代儿科杂志，2010，12（3）：215-218.

[15] 涂然，王寿勇. SDF-1/CXCR4与炎性疾病的相关研究进展[J]. 医学综述，2016，22（4）：653-656.

[16] Su X，Taniuchi N，Jin E，et al. Spatial and phenotypic characterization of vascular remode ling in a mouse model of asthma[J].Pathobiology，2008，75（1）：42-56.

[17] 周涵，程雷. 低氧诱导因子1α与变应性气道疾病[J]. 中华临床医师杂志（电子版），2013，7（20）：9288-9292.

[18] Altenburg JD，Broxmeyer HE，Jin Q，et al. A naturally occurring splice variant of CXCL12/stromal cell-derived factor 1 is a potent human immunodeficiency virus type 1 inhibitor with weak chemotaxis and cell survival activities[J]. Journal of Virology，2007，81（12）：8140-8148.

[19] Tauro S，Coutinho E，Srivastava S. An antiparallel sheet and aturn characterize the structure of antiviral Hiv-I peptide T140，AS revealed by 2d Nmr and Md simulations[J]. Proteinand Peptide Letters，2003，10（4）：346-360.

[20] 文小波. 趋化因子受体CXCR4、CCR3在肾透明细胞癌中的表达及临床意义[D]. 苏州大学，2012.