花榜清，吴正钧

（光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海乳业生物工程技术研究中心，乳业生物技术国家重点实验室，上海 200436）

牛类芽孢杆菌BD3526是从西藏地区牦牛乳中分离出的一种新的菌株，前期研究发现，其能产生胞外多糖[1]，且该胞外多糖能刺激脾脏细胞增殖，诱导肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的表达，具有作为天然免疫调节剂的潜力[2-3]。同时，其还能产生凝乳酶[4]，其产生的凝乳酶活力是商业米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）来源凝乳酶的1.33 倍[5]。除此之外，牛类芽孢杆菌BD3526还能产生α-葡萄糖苷酶抑制剂，具有良好的降糖效果[6]。大鼠体外实验表明，牛类芽孢杆菌BD3526的发酵产物能降低大鼠肠黏液中的炎症因子水平，从而抑制炎症反应，改善2型糖尿病症状[7]。牛类芽孢杆菌BD3526的发酵上清液还能促进乳品中常用植物乳杆菌ST III的生长和凝乳[8]，该菌株在人工消化液环境中具有良好的存活能力，且不具有溶血作用，具有作为益生菌应用的潜力[9]，对食品开发具有重要意义。

临床抗生素的耐药性问题一直是人类面临的难题之一[10]，微生物抗菌肽（microbial antimicrobial peptides，AMP）作为一种新型的抗菌物质，与传统的抗生素相比，对多种细菌感染有效，被认为是真核细胞和原核细胞入侵的第一道防线，来自芽孢杆菌的AMP是克服目前无效抗生素的候选物质之一[11-13]。刘玉娟等[14]发现，生长在TYC培养基上的牛类芽孢杆菌BD3526菌体通过丙酮浸提后能得到具有抗菌活性的物质，进一步提高了牛类芽孢杆菌BD3526的开发及利用价值。关于牛类芽孢杆菌BD3526产抗菌物质的研究，在其麸皮发酵液中分离出2 种抗菌物质，分别为杀镰孢菌素LI-F04a和一种新的抗菌物质Bovisin，Bovisin是LI-F04a的衍生物，其在胍基上比LI-F04a多了-(CH2)2-结构，且其与LI-F04a均具有热稳定性好、耐酸碱的特性[15]。本研究主要探讨牛类芽孢杆菌BD3526在新培养基中产生的抗菌物质的初步分离及特性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂乳粉（含54.5%乳糖、32.9%蛋白质、0.9%脂肪、7.9%矿物质和3.8%水分） 新西兰恒天然公司。

营养琼脂 上海盛思生化科技有限公司；酵母抽提物 上海拜力生物科技有限公司；葡萄糖、淀粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钠、无水乙醇、甲醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；Sephadex LH-20凝胶柱 美国GE Healthcare公司。

供试菌为牛类芽孢杆菌BD3526（Paenibacillus bovisBD3526），指示菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CGMCC1.879、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）CGMCC1.1848、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）CGMCC1.9136、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC63501、大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC25922和沙门氏菌（Salmonella）ATCC13076，以上菌株均来自乳业生物技术国家重点实验室。

牛类芽孢杆菌生长培养基（含脱脂乳粉40 g/L、琼脂12 g/L）、牛类芽孢杆菌种子液培养基（含脱脂乳粉40 g/L）、牛类芽孢杆菌发酵培养基（含葡萄糖20 g/L、淀粉20 g/L、硫酸铵20 g/L、酵母提取物10 g/L、磷酸氢二钾2.6 g/L、七水硫酸镁0.5 g/L、氯化钠0.25 g/L）、指示菌生长培养基（含牛肉膏1 g/L、酵母膏2 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化钠5 g/L、琼脂15 g/L） 自制。

1.2 仪器与设备

GNP-9270隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；TH-CB-402超净工作台 美国Labconco公司；HVE-50高压蒸汽灭菌锅 日本Hirayama公司；TE612-L电子天平 美国Sartorius公司；Avanti J-301高效离心机、AVANTI J30I高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter有限公司；Biofuge Strators高速冷冻离心机德国Heraeus公司；Micro 17R微量台式离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司；5417R小型冷冻离心机德国Eppendorf公司；Laborota 4000旋转蒸发器 德国Heidolph公司；DHL-A恒流泵、BSA-100B自动部分收集器 上海青浦沪西仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 菌株培养

供试菌株的培养：将菌株划线接种于脱脂乳琼脂平板上，置于30 ℃培养箱中培养48 h，备用。

指示菌株的培养：将菌株划线接种于营养琼脂平板上，置于37 ℃培养箱中培养24 h，备用。

1.3.2 发酵种子液的制备

在脱脂乳琼脂平板上挑取牛类芽孢杆菌BD3526单菌落，接种到20 mL脱脂乳液体培养基中，于30 ℃、180 r/min摇床培养18 h，即得发酵种子液。

1.3.3 发酵液的制备

取发酵种子液，以体积分数3.0%接种量接入发酵培养基中，于30 ℃、180 r/min摇床培养48 h，即得发酵液。利用牛津杯法测定抗菌物质的活性，平板计数法测定活菌数量。

1.3.4 最小抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的测定

采用2 倍稀释法稀释待测样品，在指示菌平板上滴加10 μL稀释后的样品，观察抑菌圈出现情况。能抑制指示菌生长的最小质量浓度即为该样品的MIC。

1.3.5 热稳定性的测定

分别取1 mL发酵液，于120 000 r/min条件下离心5 min，去除菌体和沉淀，取上清液分别置于50、60、70、80、90 ℃水浴中保温1 h，沸水浴30 min，121 ℃条件下处理15 min，取100 μL经热处理后的样品，以未经热处理的样品作对照，检测抗菌活性。每组实验平行测定3 次，取平均值。

1.3.6 pH适用范围的测定

分别取1 mL发酵液，于120 000 r/min条件下离心5 min，取上清液，分别调节pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10，取100 μL处理后的样品，以未经处理的样品作对照，检测抗菌活性。每组实验平行测定3 次，取平均值。

1.3.7 酶敏感性的测定

分别取1 mL发酵液，于120 000 r/min条件下离心5 min；分别称取4 mg胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和链霉蛋白酶，分别溶解在20 mmol/L、pH 7的磷酸盐缓冲溶液中，将pH值调节至各酶的最适pH值（胰蛋白酶最适pH值7.8～8.5，胃蛋白酶最适pH值2.0～3.0，蛋白酶K最适pH值7.2～7.5，链霉蛋白酶最适pH值7.8～8.0），使其最终质量浓度为8 mg/mL；将各酶溶液分别与发酵上清液混合，使各酶最终质量浓度为2 mg/mL，将混合液在37 ℃水浴中保温3 h，取100 μL经酶处理后的样品，以加入同体积的磷酸盐缓冲溶液样品作为对照，检测抗菌活性。每组实验平行测定3 次，取平均值。

1.3.8 粗提物的制备

将发酵液于120 000 r/min条件下离心5 min，取上清液50 mL，加入同体积的无水乙醇，4 ℃条件下静置12 h，于120 000 r/min条件下离心5 min，上清液于50 ℃旋转蒸发仪中蒸发至体积为5 mL。

1.3.9 Sephadex LH-20凝胶柱层析

使用Sephadex LH-20凝胶柱层析，体积分数75%甲醇溶液作为流动相，以4 倍柱体积的流动相冲洗柱子，待柱子平衡后，加入2%柱床体积的样品，进行洗脱，流速设定为4.0 mL/min，每2 min收集1 管，共收集2 个柱体积的样品。使用点种法测定各管样品的抗菌活性。

1.4 数据处理

利用Excel软件进行实验数据处理及绘图。

2 结果与分析

2.1 牛类芽孢杆菌BD3526发酵过程中的生长曲线

图 1 牛类芽孢杆菌BD3526发酵过程中抗菌物质的产生情况Fig. 1 Production of antimicrobial substances by Paenibacillus bovis BD3526 during fermentation

测定牛类芽孢杆菌BD3526在组合培养基中发酵96 h的菌落总数和抗菌物质产生情况。由图1可知，牛类芽孢杆菌BD3526在3 h后开始进入对数生长期，24 h左右进入稳定期，其活菌数在稳定期能达到9.30 （lg（CFU/mL））（即2.36×109CFU/mL），与其在麸皮发酵培养基中的生长曲线类似[16]。牛类芽孢杆菌BD3526在发酵15 h时检测到抗菌活性，随着发酵时间的延长，其抗菌活性逐渐增强，48 h时的抑菌圈直径为20.24 mm，抗菌活性达到最大，随后抗菌活性缓慢减弱。牛类芽孢杆菌BD3526可能为了对其产生的抗菌物质进行自我免疫，分泌了一种胞外免疫原性蛋白酶作为防御[17-18]。而前期研究中，牛类芽孢杆菌BD3526在麸皮发酵培养基中生长时，72 h抗菌活性达到最大[16]。因此，后续实验主要探究牛类芽孢杆菌BD3526在组合发酵培养基中产生抗菌物质的特性。

2.2 牛类芽孢杆菌BD3526产抗菌物质的MIC

分别选取4 株革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌CGMCC1.879、藤黄微球菌CGMCC1.1848、单增李斯特菌CGMCC1.9136及枯草芽孢杆菌ATCC63501）和2 株革兰氏阴性菌（大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC13076）作为指示菌株，通过测定发酵上清液的MIC来确定牛类芽孢杆菌BD3526在组合培养基中产生物质的抗菌特性。

表 1 牛类芽孢杆菌BD3526发酵上清液对不同菌株的MICTable 1 Minimum inhibitory concentration (MIC) of fermentation supernatant of Paenibacillus bovis BD3526 against different strains

由表1可知，牛类芽孢杆菌BD3526在组合培养基中产生的抗菌物质在较高质量浓度时对指示菌株中的革兰氏阳性菌有明显的抑制作用，对革兰氏阴性菌则没有明显的抑制作用。牛类芽孢杆菌BD3526对金黄色葡萄球菌CGMCC1.879、藤黄微球菌CGMCC1.1848的MIC均为10.00 mg/mL，对单增李斯特菌CGMCC1.9136、枯草芽孢杆菌ATCC63501的MIC均为20.00 mg/mL。

2.3 牛类芽孢杆菌BD3526发酵上清液中抗菌物质的热稳定性

图 2 不同温度热处理后牛类芽孢杆菌BD3526发酵上清液的抗菌活性Fig. 2 Antibacterial activity of fermentation supernatant of Paenibacillus bovis BD3526 after different heat treatments

牛类芽孢杆菌BD3526发酵上清液经不同温度热处理，由图2可知，牛类芽孢杆菌BD3526在该组合培养基中产生的抗菌物质在经过高温121 ℃、15 min处理后依旧保持较好的活性，表明牛类芽孢杆菌BD3526在该组合培养基中产生的抗菌物质具有较好的热稳定性，更有利于后期的开发利用。

2.4 牛类芽孢杆菌BD3526发酵上清液中抗菌物质的pH值适用范围

图 3 不同pH值条件下牛类芽孢杆菌BD3526发酵上清液的抗菌活性Fig. 3 Antibacterial activity of fermentation supernatant of Paenibacillus bovis BD3526 at different pH values

由图3可知，牛类芽孢杆菌BD3526发酵上清液中抗菌物质的抗菌活性在pH值2～10范围内比较稳定。在人类所食用的食物中，有些食物pH值低至3左右[19]，正常人体胃液pH值为0.9～1.8[20]，抗菌物质耐酸碱的特性为其应用提供了更大的可能性。

2.5 牛类芽孢杆菌BD3526发酵上清液中抗菌物质的酶敏感性

图 4 不同酶处理后牛类芽孢杆菌BD3526发酵上清液的抗菌活性Fig. 4 Antibacterial activity of fermentation supernatant of Paenibacillus bovis BD3526 after being digested by different enzymes

由图4可知，牛类芽孢杆菌BD3526发酵上清液中的抗菌物质在经过胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K处理后，其抗菌活性未发生明显变化，而经链霉蛋白酶处理后，抗菌活性明显下降。链霉蛋白酶是自灰色链霉菌中分离的非特异性蛋白水解酶，能作用于肽键间的氨基酸，表明牛类芽孢杆菌BD3526发酵上清液中的抗菌物质可能存在肽类物质。

2.6 牛类芽孢杆菌BD3526抗菌物质的初步分离纯化

选取体积分数75%甲醇溶液进行等度洗脱，测定每管洗脱液的抑菌活性。由图5可知，第21～24、28～31管洗脱液具有抗菌活性，表明牛类芽孢杆菌BD3526在该组合培养基中发酵产生了至少2 种不同的抗菌物质，这与牛类芽孢杆菌BD3526麸皮发酵液初步分离纯化的结果有所不同[15]。

图 5 牛类芽孢杆菌BD3526发酵上清液经Sephadex LH-20凝胶柱层析后的洗脱曲线Fig. 5 Elution curve of fermentation supernatant of Paenibacillus bovis BD3526 purified from Sephadex LH-20 gel column chromatography

3 结 论

使用组合培养基作为牛类芽孢杆菌BD3526的发酵培养基，其发酵上清液对指示菌株中的革兰氏阳性菌有明显的抗菌作用，该发酵上清液具有良好的热稳定性、耐酸碱，经链霉蛋白酶处理后活性明显下降，表明发酵液中含有肽类抗菌物质。采用Sephadex LH-20凝胶柱层析获得初步纯化的样品，经过对洗脱液的活性检测发现，该发酵上清液至少含有2 种抗菌活性物质，根据抗菌物质在凝胶柱上保留时间的不同，初步判定牛类芽孢杆菌BD3526在该组合培养基中产生了与前期在麸皮发酵液中不同的抗菌物质。关于该组合培养基中产生的抗菌物质只做了初步分离，后期还需对其进行进一步纯化，并进行结构鉴定以及实际应用方面的研究，从而为食品、医药等领域带来新的突破。