刘进杰 吕娟娟 陈国忠

摘要：纯化从烟台海域沙质土壤分离得到的莫海威芽孢杆菌菌株amyP216来源壳聚糖酶，并对其进行酶学性质分析。以发酵液为原料，依次进行超声波破碎菌体、20%～70%硫酸铵分级盐析、纤维素DE-32阴离子交换层析、葡聚糖凝胶G-75过滤层析，得到壳聚糖酶。采用SDS-PAGE凝胶电泳测定分子量为30 ku，全波段扫描结果显示在 324 nm 处出现最高峰。然后对壳聚糖酶的酶学性质进行研究。结果表明，最适反应温度为55 ℃，且在一定范围内温度越低，其热稳定性越高;最适反应pH值为5.5，中性条件下酶活性最稳定;在金属离子中Mn2+对其激活作用最明显，其他金属离子对其有抑制作用;该酶具有相对较好的底物特异性。

关键词：壳聚糖酶;莫海威芽孢杆菌;分离纯化;酶学性质;底物特异性

中图分类号： S188+.3  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）14-0231-05

壳寡糖在食品、医药、农业等行业都有着很高的应用价值，具有抗疲劳、调节免疫力和抗肿瘤的功效[1-4]，可有效抑制肝损伤[5-6]，还具有降血脂、降血糖的功能[6-9]。壳寡糖还可用于调节植物生长、延长果蔬保鲜等[10-13]。壳寡糖是由壳聚糖酶专一性地降解壳聚糖后生成的，因此寻求具备高效降解能力的壳聚糖酶，具有较高的工业应用价值。

壳聚糖酶是一类可催化氨基葡萄糖间的β-1，4-糖苷键断裂的酶[14]，其来源广泛，广泛存在于一些真菌、细菌、放线菌中，甚至在植物病原菌、病毒中也有存在[15-19]。由于壳聚糖酶来源不同，酶学性质也就不同，酶解产物壳寡糖的聚合度也会有所不同[20]。因此，对不同微生物来源的壳聚糖酶进行分离纯化，研究其酶学性质，已经成为国内外的研究热点。

前期工作中，笔者在烟台海域沙质土壤中分离到1株壳聚糖酶产生菌株——莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）amyP216，并对其发酵产生壳聚糖酶的条件进行了优化[21]。在本研究中，对发酵液中的壳聚糖酶进行分离纯化，探讨其酶学性质，为该壳聚糖酶的更深入研究奠定理论基础，也为该酶的工业应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

1.1.1 菌株 莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）菌株amyP216，由笔者所在实验室从烟台海岸带沙质土壤分离筛选获得。

1.1.2 试剂 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、醋酸、乙酸钠、3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、四水酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠，均为国产分析纯;葡聚糖凝胶G-75（Pharmacia）、纤维素DE-32，购自江苏南京奥朵福尼生物科技有限公司;壳聚糖，购自山东济南海得贝生物工程有限公司;标准蛋白marker，由中国科学院上海生物化学研究所监制。

1.1.3 仪器设备 Ф3.5 cm×70 cm层析柱，购自上海华美实验仪器厂;HL-2恒流泵，购自上海沪西仪器厂有限公司;SBS-100数控记滴自动部分收集器，购自上海青浦沪西仪器厂;Z-323-K高速冷冻离心机、TDL-60B低速台式离心机，购自上海安亭科学仪器厂;WFJ7200可见光分光光度计，购自尤尼科（上海）仪器有限公司;MD34透析袋（美国Viskase）;BS224S电子分析天平，购自北京赛多利斯仪器有限公司;KDS超声波细胞粉碎机，购自浙江宁波新芝科技有限公司;HH-6水浴锅，购自江苏省金坛市双捷实验仪器厂。

1.2 菌株培养

1.2.1 培养基 LB斜面培养基：酵母浸粉5 g/L、蛋白胨 10 g/L、NaCl 2.5 g/L、琼脂20 g/L，pH值7.0。

液体种子培养基：胶体壳聚糖10 g/L、酵母浸粉5 g/L、MgSO4 0.5 g/L、NaCl 2.5 g/L、KH2PO4 2 g/L，pH值6.5。

发酵培养基：壳聚糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、MgSO4 0.5 g/L、NaCl 2.5 g/L、KH2PO4 2 g/L、CaCl2 0.1 g/L，pH值6.5[21]。

1.2.2 培养方法 菌种活化：取甘油管保藏菌种划线至LB斜面培养基，30 ℃培养24 h。

种子液：挑取单菌落接种至液体种子培养基，30 ℃、200 r/min 培养24 h。

摇瓶发酵：500 mL三角瓶装50 mL发酵培养基，按5%接种量将种子液接入发酵培养基，30 ℃、220 r/min培养60 h。

发酵罐培养：按5%接种量将种子液接入装有3 L发酵培养基的5 L自控发酵罐中，转速600 r/min，通气量 2 L/（L·min），温度30 ℃[21]。

1.3 壳聚糖酶的分离纯化

取发酵罐培养的发酵液，4 ℃、8 000 r/min离心15 min后，收集菌体。超声波破碎20 min后，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，取上清液，加入硫酸銨至饱和度20%，4 ℃过夜，10 000 r/min 低温离心30 min，取上清液，继续加入硫酸铵固体至饱和度70%，4 ℃过夜，10 000 r/min低温离心30 min，收集沉淀。将沉淀溶解于0.02 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值8，含1 mol/L NaCl）中，透析浓缩后得粗酶液[16，22]。

取粗酶液3 mL进行纤维素DE-32柱层析，并用 0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH值8，含1 mol/L NaCl）进行洗脱，合并有酶活的部分并浓缩。然后采用葡聚糖凝胶G-75柱层析，并用0.02 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值8，含1 mol/L NaCl）作为洗脱液进行洗脱，合并有酶活的部分并进行浓缩[22-24]。

浓缩后的样品采用SDS-PAGE凝胶电泳的方法进行酶蛋白的纯度分析以及相对分子质量的测定，分离胶的质量分数为15%，浓缩胶质量分数为5%[25]。

1.4 壳聚糖酶的酶学性质研究

1.4.1 温度及最适温度的测定 将酶液与壳聚糖底物分别放于35、45、55、65、75、85 ℃水浴中反应15 min，以确定酶的最适反应温度。将酶液在上述温度中保温120 min，以探讨热稳定性。

1.4.2 pH值及最适pH值的测定 将酶液与壳聚糖底物放于pH值分别为4、5、6、7、8、9的磷酸缓冲液中反应30 min，测定酶活，以确定最适反应pH值。将酶液放于上述的缓冲液中，保温2 h，测定酶活性，以探讨pH值稳定性。

1.4.3 金属离子对酶活性的影响 等量酶液与底物混合，加入不同金属离子，使离子浓度达到0.5 mmol/L。不同金属离子分别为Mn2+（MnSO4）、Mg2+（MgSO4）、Ca2+（CaCL2）、Cu2+（CuSO4）、Fe3+[Fe2（SO4）3]、Ba2+（BaSO4）、Li+（Li2SO4）、Zn2+（ZnSO4），以不加金属离子为对照，计算相对酶活性并作图，以探讨金属离子对酶活性的影响。

1.4.4 底物特异性 分别取1%壳聚糖醋酸溶液、胶体壳聚糖、羧甲基壳聚糖、胶体甲壳素、羧甲基纤维素钠作为底物反应，保温15 min，以壳聚糖为底物作为对照，计算相对酶活性并作图，以探讨壳聚糖酶对底物的专一性。

1.5 检测方法

1.5.1 壳聚糖酶活性测定 采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）测定还原糖的方法测定壳聚糖酶的活性[16，24]。以氨基葡萄糖为标准绘制标准曲线，其回归方程为y=0.083 93x+0.033 7。式中：y为吸光度D值;x为浓度，μmol/mL;r2=0.996 77。酶活性单位定义为1 mL发酵液 1 min 下释放生成的微摩尔还原糖。

1.5.2 蛋白质浓度测定 蛋白质浓度采用Bradford法[25]，以牛血清白蛋白（BSA）为标准绘制标准曲线，牛血清蛋白标准曲线的回归方程为y=1.593 43x-0.042 12。式中：y为D值;x为浓度，μmol/mL;r2=0.999 26。

1.6 数据处理与分析

利用SPSS 19.0进行数据处理和误差分析，用Origin 8绘图软件绘制图形。每组试验做3个平行试验，以3组数据进行误差分析以得到准确的试验结论。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖酶的分离纯化

将破壁、盐析、透析后壳聚糖酶粗酶液上样于磷酸盐缓冲液平衡好的DEAE层析柱，随后用0.02 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值8，含1 mol/L NaCl）进行洗脱，洗脱结果如图1所示。试验共收集30管样品，每管2.5 mL。在第18管处出现第1个酶活性和蛋白质浓度最高峰，且酶活性峰值与蛋白浓度峰值基本重合;在第22管处出现第2个酶活性和蛋白质浓度高峰，但其酶活性和蛋白质含量明显低于第1个峰。可见，壳聚糖酶的酶活性主要集中在第1个蛋白峰处。

把经纤维素DE-32洗脱得到的第1个蛋白峰处的样品收集、浓缩，上样到葡聚糖凝胶G-75层析柱进一步分离纯化，洗脱图谱如图2所示。试验中共收集17管样品，每管 4 mL，酶活性检测发现第6管和第11管处的蛋白样有明显的壳聚糖酶活性，第6管酶活性较高。蛋白峰出现在第5管和第10管处，第5管处蛋白浓度略高。

由表1可知，经过盐析、纤维素DE-32交换层析和葡聚糖凝胶G-75层析等一系列纯化后，壳聚糖酶比活力达到 8.01 mol/（min·mg），回收率为4.4%。

对葡聚糖凝胶G-75层析中第6管处样品进行SDS-PAGE电泳检测其分析纯度和相对分子质量，结果如图3所示。样品为单一条带，说明所分离的壳聚糖酶纯度较高，与标准蛋白marker比对，可以得出分子量约为30 ku，这与Shimosaka等（31.9 ku）[19]、孙菲等（30 ku）[23]、段妍等（30.5 ku）[24]所纯化的壳聚糖酶相对分子质量大致相当;但是与Gao等（41 ku）[26]、Muslim等（45 ku）[18]、韩宝芹等（66.2 ku）[27]、Wang等（21、18 ku）[28]、Shehata等（130 ku）[29]纯化相差较大。可见，不同来源的壳聚糖酶的相对分子质量有明显的差异。

由图4可知，壳聚糖酶在324 nm处有最大吸光度，数值为0.265，具有一般酶蛋白的紫外吸收特征。

2.2 壳聚糖酶酶学性质研究

2.2.1 温度及温度稳定性测定 由图5可知，曲线呈现先上升后下降的趋势，最高点出现在55 ℃处。55～65 ℃，曲线呈直线下降，当超过65 ℃时，酶活性降至很低，可能是因为温度过高使壳聚糖酶变性失去活性。可见，壳聚糖酶反应的最适温度在55 ℃，这与杨立红等所纯化的壳聚糖酶的最适温度[16，22，30]相同，但是与Gao等（60 ℃）[26]、Wang等（50 ℃）[28]、Shehata等（40 ℃）[29]所纯化的壳聚糖酶的最适温度不同。

由图6可见，在一定范围内，温度越低，对酶的稳定性越好。所有曲线都呈现下降趋势。在保温60 min后50、60 ℃ 保温条件下，酶活性均消失，在60 ℃下壳聚糖酶更快失去酶活;保溫90 min后，30、40 ℃也失去了酶活，40 ℃保温条件下，相对酶活性下降得更快，即壳聚糖酶更容易失去酶活性。

2.2.2 pH值及pH值稳定性测定 pH值对壳聚糖酶活性的影响如图7所示，曲线呈先上升后下降的趋势。在pH值5.5之前，酶活性随pH值的升高而上升，当pH值达到6以后，酶活性急剧下降，在pH值5.5处出现最高峰，可见壳聚糖酶反应的最适pH值为5.5，这与Shehata等（40 ℃）[29]、隋斯光等[31]研究的壳聚糖酶的最适pH值相同。当pH值为 6.0 时，本试验所纯化得到的壳聚糖酶的活性大大降低，但是Gao等纯化的壳聚糖酶的最适pH值却是6.0[26，32]。这表明不同来源的壳聚糖酶的最适pH值差距较大，莫海威芽孢杆菌amyP216来源的壳聚糖酶的最适pH偏酸性。

pH值对酶活稳定性的影响如图8所示。时间越长，相对酶活性越小，在pH值为7即中性环境下，相对酶活性降低较慢，说明保温时间对酶活性的影响最小;pH值6环境下，酶活性降低程度次之;pH值4和5对酶活性的稳定性影响较大，pH值为4时相对酶活性下降最快，对酶活性稳定性影响最大。由此可得，pH值7最適合壳聚糖酶的保存。

2.2.3 金属离子对酶活性的检测 金属离子对壳聚糖酶的影响结果如图9所示，本试验所验证的金属离子中，正1价金属离子Li+对酶活性有明显的抑制作用，在浓度达到 0.5 mmol/L 时，其相对酶活性为76.7%。正2价金属离子中，Mn2+对酶活性有激活作用，在金属离子浓度为0.5 mmol/L时，其相对酶活性达到263.1%，其原因可能与酶的活性中心有关。Mg2+、Ca2+、Cu2+、Ba2+、Zn2+等都有一定的抑制作用，其中Ba2+的抑制作用最弱，相对酶活性为90.1%，Cu2+的抑制作用最强，相对酶活性达到39.7%。正3价金属离子Fe3+对酶活性同样有严重的抑制作用，是以上8种离子中抑制作用最强的，相对酶活性达到34.3%。

在本试验所研究的金属离子中，只有Mn2+对酶活性有激活作用，其他金属对酶活性均有抑制作用。这与其他来源的壳聚糖酶的试验结果也有所不同。Wang等研究发现Mn2+会抑制Serratia marcescens TKU011来源的壳聚糖酶[28]，周念波等研究发现Zn2+、Ca2+对Bacillus sp. LS产的壳聚糖酶有一定的激活作用[22]，这进一步表明不同微生物来源的壳聚糖酶的酶学性质是有差异的。

2.2.4 底物特异性检测 如表2所示，壳聚糖酶对壳聚糖的水解能力最强，对羧甲基纤维素钠、DEAE纤维素和甲壳素也有一定的水解能力，其水解能力依次降低。可见，纯化所得的壳聚糖酶底物特异性较好。

3 结论

壳聚糖酶是理想的制备壳寡糖的酶制剂，本研究以高产壳聚糖酶的莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis） amyP216发酵液为原料，经过超声波破壁处理、硫酸铵分级沉淀、纤维素DE-32阴离子交换柱层析、葡聚糖凝胶过滤层析等方法纯化后，得到了电泳纯壳聚糖酶，纯化倍数达到25.21倍，相对酶活性为8.01 mol/（min·mg），回收率为4.4%。电泳法测定莫海威芽孢杆菌来源壳聚糖酶相对分子质量为30 ku，全波段扫描结果显示在324 nm处出现最高峰，峰值为0.265 Abs。

经酶学性质研究发现，该壳聚糖酶的最适反应温度为 55 ℃，在试验范围内，温度越低，酶的稳定性越好;最适反应pH值为5.5，在pH值7时酶的稳定性较好;在试验范围内，金属离子Mn2+对其激活作用最明显，Mg2+、Ca2+、Cu2+、Ba2+、Zn2+等金属离子对其有抑制作用;该酶具有相对较好的底物特异性。下一步研究将对该酶进行基因工程研究，以提高酶的表达量，为其产业化奠定基础。

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