瞿运秋 赵文佳 陈继光

摘要：前期从余甘子中分离鉴定了一系列对α-葡萄糖苷酶有较好抑制活性的没食子单宁成分，柯里拉京为其中的1个主要活性成分，本试验进一步对柯里拉京抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用机制进行了研究。采用体外微量96孔板α-葡萄糖苷酶-PNPG反应模型测定了柯里拉京对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，并进行了抑制动力学试验，以非线性拟合法分析了其对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学参数，同时采用分子对接模型研究了柯里拉京与α-葡萄糖苷酶相互作用的机制。结果表明，柯里拉京对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50为15.33 μmol/L，显著低于阳性对照阿卡波糖的IC50（79.88 μmol/L）;非线性拟合结果发现，柯里拉京对α-葡萄糖苷酶的抑制作用为混合型抑制;氢键是柯里拉京与α-葡萄糖苷酶之间相互结合的主要作用力。结果为柯里拉京作为降糖保健品或药品开发提供了理论依据。

关键词：余甘子;柯里拉京;α-葡萄糖苷酶;酶动力学;酶抑制;分子对接

中图分类号： R285.5  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）14-0206-03

以胰岛素抵抗为特征的Ⅱ型糖尿病占糖尿病发病总数90%以上，我国Ⅱ型糖尿病的患病人数占总人口10%左右，成为全球糖尿病患病人数第二大国[1]。糖尿病主要对眼睛、肾脏、神经心血管、下肢血管等造成损害并发症，甚至导致多器官功能衰竭，因此针对糖尿病的治疗主要以控制血糖水平，预防并发症的发生为主。以阿卡波糖为代表的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有很好地控制餐后血糖水平的功效，是临床常用的治疗糖尿病药物。

α-葡萄糖苷酶是存在于小肠绒毛膜上的一组酶系，能够催化食物中淀粉、蔗糖和麦芽糖等多糖、寡糖和二糖水解为可吸收的单糖（葡萄糖和果糖）。α-葡萄糖苷酶的抑制剂通过竞争抑制α-葡萄糖苷酶活性，延缓多糖、寡糖和二糖向单糖的转化，控制餐后血糖浓度[2]。最近几年，以α-葡萄糖苷酶为作用靶点，从药用、可食性植物或微生物中筛选活性成分是研究热点[3-6]。对α-葡萄糖苷酶有抑制作用的植物活性成分主要包括萜类、生物碱、醌类、黄酮、多酚、苯丙烷和类固醇化合物等[7]。多酚类化合物可以通过多途径抑制α-葡萄糖苷酶活性，金银花花蕾中3，5-二咖啡酰奎宁酸通过非竞争性抑制小肠α-葡萄糖苷酶活性[8];然而，刘雪辉等对从紫甘薯茎叶中分离的4个高纯度咖啡酰基奎宁酸类似物（绿原酸、4，5-O-咖啡酰基奎宁酸、3，5-O-咖啡酰基奎宁酸及3，4-O-咖啡酰基奎宁酸）抑制α-葡萄糖苷酶活性机制进行了研究，结果表明，这些物质对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争性抑制[9]。因此对同一个化合物抑制α-葡萄糖苷酶机制进行研究，不同的学者会得出不同的结论，笔者所在课题组前期通过5种方法对阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶酶促反应的动力学数据进行了详细地分析，结果表明，非线性拟合法更加简便、合理及可靠，可以是研究酶促动力学的首选方法[10]。

余甘子为大戟科叶下珠属植物的干燥成熟果实，有机酸类物质是其主要成分，前期从余甘子降血糖活性部位分离鉴定出7个酚类活性成分，均具有很好的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用[11]，尤其是没食子酸和柯里拉京活性最强。柯里拉京是一种逆没食子酸鞣质，主要存在于龙眼核、余甘子、叶下珠全草、龙眼壳、榄仁树叶和纤梗叶下珠全草等植物中[12]，具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗血栓、抑制病毒、抗菌、抗炎、降血压等药理作用，具有很大的药用前景[13]。《中华人民共和国药典》（2015版）规定没食子酸为评价余甘子质量的指标成分，目前有较多学者报道增加多酚类成分柯里拉京为余甘子的另一个质控指标。

为了进一步探讨柯里拉京对α-葡萄糖苷酶的抑制作用机制，本研究采用非线性拟合法对其抑制α-葡萄糖苷酶酶促反应的动力学数据进行分析，采用分子对接技术，初步探讨其作用α-葡萄糖苷酶的主要作用位点，以期确定其抑制 α- 葡萄糖苷酶的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

α-葡萄糖苷酶，购自美国Sigma公司;4-硝基苯基-α-D- 吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG），購自美国Sigma公司;阿卡波糖（Acarbose），购自广东省广州市亿邦医药科技有限公司;对硝基苯酚（PNP），购自上海展云化工有限公司;磷酸二氢钾和磷酸氢二钾（国产分析纯），购自西陇化工股份有限公司;甘油（国产分析纯），购自上海瑞楚生物科技有限公司;实验用水均为超纯水。

1.2 主要仪器

SpectraMax M2型酶标仪，美国分子仪器有限公司（Molecular Devices）;HH60型数显恒温搅拌循环水箱，江苏南京温诺仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂的配制 PBS（磷酸盐缓冲液）：称取4.559 g KH2PO4和7.646 g K2HPO4·3H2O，以去离子水定容至 500 mL，调节pH值至6.8，121 ℃灭菌20 min，4 ℃贮存备用;α-葡萄糖苷酶：将α-葡萄糖苷酶冻干粉溶于含50%甘油的磷酸盐缓冲液（pH值6.8），配制成100 U/mL的酶溶液，分装，-20 ℃冻存备用;PNPG、PNP、阿卡波糖均以磷酸缓冲液配制，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.3.2 PNP测定标准曲线的绘制 取不同体积的PNP标准品溶液于96孔板中，以PBS补足至200 μL，配成0、0.03、0.06、0.15、0.30、0.60、1.50、3.00、6.00、12.00、24.00、48.00、96.00 nmol的系列PNP标准品溶液，于405 nm处测定吸光度，重复测定4次。以吸光度（D）为横坐标，PNP的物质的量为纵坐标，绘制测定标准曲线。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制率的测定方法 以微量的96孔板α-葡萄糖苷酶-PNPG反应体系为模型进行检测，具体操作如下：依次往各反应孔中加入PBS、α-葡萄糖苷酶（1 U/mL）5 μL、待测抑制剂样品10 μL，混匀后置于37 ℃水浴中孵育20 min;加入16 μL的PNPG（2.5 mmol/L），置于 37 ℃ 水浴中反应6 min，于405 nm波长下测定吸光度，重复检测3次，每次设4个平行处理。以阿卡波糖为阳性对照物，浓度设为1.0 mmol/L;待测抑制剂设5、10、20、40、80 μmol/L 5个浓度梯度。

酶活抑制率=（D空白-D样品）/D空白×100%。

式中：D空白為未加抑制剂组的吸光度;D样品为待测抑制剂组的吸光度。采用Graphpad prism 5.0软件处理试验数据，计算待测抑制剂的半抑制浓度（IC50）。

1.3.4 抑制剂抑制动力学检测方法 基于微量的96孔板 α- 葡萄糖苷酶-PNPG反应体系进行检测，具体操作如下：依次往各反应孔中加入PBS、α-葡萄糖苷酶（1 U/mL）5 μL和待测抑制剂溶液10 μL（以阿卡波糖阳性对照物），混匀后置于37 ℃水浴中孵育20 min;每孔分别加入0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500、0.600、0.800、1.000 mmol/L 的PNPG，于 37 ℃ 水浴中反应6 min，405 nm波长下测定吸光度，计算反应速度，重复检测3次。采用Origin 8.4软件，以底物浓度（S）为自变量、反应速度（v）为因变量进行非线性拟合，计算抑制剂作用下反应体系的表观vmax和表观Km，并通过方差分析来判断vmax和Km的差异显著性，据此确定待测抑制剂的抑制作用类型。

1.3.5 酶与抑制剂分子对接方法 参照王雪洁等的方法[14]进行分子对接模拟，具体操作方法如下：

1.3.5.1 α-葡萄糖苷酶空间立体结构准备 从蛋白质晶体数据库PDB下载α-葡萄糖苷酶晶体结构文件（PDB ID：2f6d，resolution：1.6 ，其中有配体抑制剂阿卡波糖），在Linux系统下使用Pymol软件（version：1.7.2.1）去除其中的溶剂分子、磷酸根离子和钠离子，再提取原配体阿卡波糖分子（ACR），确定结合位点，然后以Autodock Tools将其转化为pdbqt格式，以此格式进行后续分子对接。

1.3.5.2 配体小分子的结构准备 从PubChem数据中下载柯里拉京（CAS：23094-69-1）3D结构文件，采用MM2力场进行能量最小化，以Autodock Tools程序添加Gasteiger电荷，合并非极性氢原子后，将其转化成pdbqt格式，作为对接配体的初始结构。

1.3.5.3 分子对接 采用Autodock Tools-grids，根据原有的配体阿卡波糖的坐标文件将Grid Box的中心坐标设置为（11.851，11.479，-6.564），格点盒子大小设置为40×46×40，格点间距设置为0.375 ，即空间大小为15 ×17.25 ×15 。使用Autodock vina软件，采用Lamarckian遗传算法（局部能量搜索与遗传算法相结合）进行对接，通过分子对接确定两者的结合位置，获得受体蛋白与配体小分子的结合自由能，分析配体与受体之间氢键结合的位置和数量以及酶蛋白与配体之间的疏水相互作用。

2 结果与分析

2.1 PNP测定标准曲线

本研究绘制了PNP测定标准曲线所得的线性回归方程为y=50.696x，其决定系数（r2）为0.999 8。

2.2 柯里拉京对α-葡萄糖苷酶的抑制效果

本研究检测了5.0～80.0 μmol/L柯里拉京对α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果，结果如图1所示。随着柯里拉京浓度的升高，抑制率不断升高，当浓度为80.0 μmol/L时，抑制率达到了59.38%。经Graphpad prism 5.0软件计算，本研究所采用的检测条件下柯里拉京的半抑制浓度IC50为 15.33 μmol/L，低于阿卡波糖的半抑制剂浓度79.88 μmol/L。由此可知，柯里拉京对α-葡萄糖苷酶有很强的抑制效果，在降糖功能食品和药物的开发方面具有很好的前景。

2.3 柯里拉京对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学

采用Origin 8.4软件对柯里拉京对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学进行了非线性拟合，拟合结果如图2所示，所得表观vmax、表观Km如表1所示。方差分析结果表明，与空白模型（无抑制剂作用下）相比，在柯里拉京作用下，反应体系的表观Km显著提高，而表观vmax极显著下降，柯里拉京表现出了显著的混合抑制作用特点[10]，因此确定柯里拉京对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型为混合型抑制。

根据酶促反应理论，混合型抑制动力学的方程为

v=vmax[S]Km1+[I]Ki+[S]1+[I]Ki。

式中：[S]为底物浓度;[I]为抑制剂浓度。

对该方程进行双倒数变换，再分别以变换后线性方程的斜率和截距对抑制剂浓度[I]作图，据此计算出了柯里拉京的抑制常数Ki和Ki′，分别为37.37 μmol/L和76.3 μmol/L。

2.4 柯里拉京与α-葡萄糖苷酶分子对接

柯里拉京与α-葡萄糖苷酶分子对接结果如图3和图4所示。通过对接分析，发现α-葡萄糖苷酶与柯里拉京分子之间4 以内的相互作用的的氨基酸有21个（图4），具体如下：PRO-61、ASP-62、TYR-63、TRP-67、LYS-127、TYR-135、ALA-138、TRP-139、GLY-140、PHE-206、TRP-209、GLU-210、GLU-211、ARG-345、TYR-351、GLY-353、ASP-354、GLY-355、SER-356、TRP-362、GLU-456。从空间对接模型图（图3、图4）可知，在酶的活性腔中，柯里拉京分子的非极性基团被极性基团包裹，其分子上的羟基与酶蛋白的氨基酸残基之间形成了12个氢键，具体如下：与ARG-345残基形成了2个氢键，与TRP-209残基形成了1个氢键，与GLU-210残基形成了1个氢键，与GLU-211残基形成了1个氢键，与SER-356残基形成了1个氢键，与TYR-63残基形成了2个氢键，与TYR-351残基形成了4个氢键。Autodock vina软件计算结果显示，两者之间的结合自由能为-33.91 kJ/mol。以上分析结果表明，氢键是柯里拉京与α-葡萄糖苷酶之间相互结合的主要作用力， 柯里拉京可以很好地结合于酶的活性口袋之中，结合自由能较低，模型较好地解释了柯里拉京对α-葡萄糖苷酶的高抑制活性。

3 结论

柯里拉京是藏藥余甘子抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性成分，半抑制浓度IC50为15.33 μmol/L，抑制效果远高于阳性对照药物阿卡波糖，非线性拟合分析表明，其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用为混合型抑制;分子对接发现氢键是柯里拉京与α-葡萄糖苷酶主要的相互作用力，后续将采用糖尿病动物模型进一步研究藏药余甘子及其柯里拉京成分的降血糖作用，可以进一步开发为降糖保健品或药品。

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