刘林峰 林玲 周阳

摘要：以红芽佛手、自选9803、安73等3个紫芽茶树品种（系）的1芽3叶茶梢为研究对象，采用紫外-可见光谱和高效液相色谱技术，分析研究不同品种（系）、不同部位、不同生长季节茶树紫色芽叶花色苷的富集特性，以期为茶树紫色芽叶及其花色苷的高值化利用提供参考。结果表明，不同品种（系）、不同部位、不同生长季节茶树对花色苷的富集能力存在显著差异;不同茶树品种（系）富集能力由强到弱依次为自选9803>安73>红芽佛手，不同部位富集能力由强到弱依次为第1>第2>芽头>第3，同时3个茶树品种（系）随春末、夏初、夏中、夏末、秋初、秋中的季节变化对花色苷的富集呈现出先上升后下降的趋势，自选9803叶片在夏末花色苷含量达到最高值（14.24 mg/g），安73在夏末达到最大值（12.63 mg/g），红芽佛手则在夏初达到最高值（7.33 mg/g）。

关键词：茶叶;紫芽;花色苷;富集特性

中图分类号：S571.101   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）14-0169-03

茶树紫色芽叶是由茶叶花色苷引起的，花色苷属多酚类物质，多以糖苷形式存在[1]，易溶于水和乙醇、甲醇等醇类化合物，不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂，在酸性条件下稳定，其颜色随pH值的变化而变化[2]。研究证实，花色苷具有抗氧化、清除自由基、护肝解毒等[3-7]多种生物活性，被广泛用于食品、饮料、医药、化工、纺织等[8]领域，是近年茶树种质资源及功能成分利用的研究热点。云南省农业科学院茶叶研究所选育了高花色苷茶树品种紫娟;刘富知等发现，4.35%的安化群体茶树品种具有高花色苷特征[9];萧力争等比较了5个特定紫芽茶树品种春梢芽叶中花色苷含量的差异[10];李燕丽等检测了不同季节紫娟茶花色苷相对含量[11];Lai等分析了紫芽茶树品种紫娟花色苷的累积情况[12]。然而，鲜见对花色苷及组分在不同品种（系）、不同部位、不同生长季节茶树中富集特性的系统研究。本研究以红芽佛手、自选9803、安73等3个紫芽茶树品种（系）的1芽3叶茶梢为对象，采用紫外-可见光谱和高效液相色谱（HPLC）技术，分析不同品种（系）、不同部位、不同生长季节茶树紫色芽叶花色苷及其组分的富集特性，以期为茶树紫色芽叶及其花色苷的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

从2016年4月中下旬开始至2016年9月中旬每15 d采摘1次湖南农业大学长安教学实践基地茶园中易紫芽化自选9803、红芽佛手和安73等3个茶树品种（系）的1芽3叶，并将其芽头、第1叶、第2叶和第3叶分开收集，冷冻干燥后制成干粉，塑料袋密封后保存于冰箱中，备用。

1.2 试剂及仪器设备

试剂：乙腈、甲醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）、无水乙醇（分析纯）均购于天津市恒兴化学试剂制造有限公司;标准品矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷购于北京谱析科技有限公司;飞燕草素-葡萄糖苷购于西宝生物科技（上海）股份有限公司;超纯水自制;酸性乙醇水溶液（85 mL 无水乙醇加15 mL 1%盐酸水）自配。

仪品设备：C18 ECOSIL HPLC COLUMN色谱分析柱（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm，日本ECOSIL公司）、UV754N紫外可见分光光度计（德国Thermo Scientific公司），高效液相色谱仪A20（日本岛津公司），精密电子天平（瑞士Starorius公司），pH计（瑞士梅特勒-托利多公司），超低温冰箱（美国Thermo公司），DSY-2-8水浴锅（北京国华医疗器械厂）。

1.3 方法

1.3.1 花色苷提取 参照文献和预试验结果，采用回流提取方法提取茶叶干粉中的花色苷，提取条件为80%乙醇（添加1%冰乙酸水溶液）、1 g ∶ 50 mL料液比，80 ℃下回流提取 60 min，过滤取滤液[13-15]。

1.3.2 紫外-可见光谱检测花色苷总量 参照报道文献，采用单一pH法，吸取4 mL样品提取滤液用酸性乙醇水溶液定容至10 mL以酸性乙醇水溶液为空白对照，显色30 min，在 535 nm 波长下测定吸光度，重复3次[16-17]，根据以下公式[18]计算花色苷总量：

花色苷總量=[（D试液-D对照液）×101.83]/[吸取溶液量/样品干质量][19]。

式中：101.83为摩尔消光系数。

1.3.3 HPLC外标法检测茶叶花色苷组分 色谱柱为C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm），柱温30 ℃，检测波长 520 nm，流动相为0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～60 min，10%～40% B），流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL，系统平衡 10 min 后再次进样。

1.3.4 统计方法 数据以平均值±标准差表示，采用SPSS Statistics 22.0进行方差分析，各处理组间采用最小显著差数法（LSD法）比较，P<0.05时表示具有统计学显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同茶树品种（系）花色苷富集差异比较

图1显示，不同茶树品种（系）所富集的花色苷总量存在显著差异（P安73（8.11 mg/g）>红芽佛手（4.98 mg/g）;同时，3个品种（系）样品和3种标准品混合标样的HPLC图谱相比，茶树紫色芽叶中的花色苷组分与其他常见植物中的花色苷组分并不相同，组分1～7为3个品种（系）所共有（图2），表示这7个组分可作为茶树紫色芽叶中的特征花色苷组分，且以组分5和组分6含量较高，但其分子结构有待进一步探究;也进一步说明在外界环境差异不大的情况下，茶树对花色苷的富集主要取决于品种（系）的遗传因素。

表1表明，同一生长季节，不同茶树品种（系）的花色苷总量存在显著差异。自选9803花色苷富集能力最强，在各生长季节与红芽佛手均存在显著性差异（P<0.05）;安73富集能力次之，在春秋（除秋初外）2季富集明显不如9803（P<0.05），在夏中和夏末则明显强于红芽佛手（P<0.05），说明茶树对花色苷的富集也受生长季节等环境因素的影响。

图3表明，芽头部分自选9803的花色苷总量显著高于安73和红芽佛手（P<0.05），第1叶部分第3个品种（系）之間差异显著（P<0.05），第2叶部分红芽佛手富集能力显著低于其他2个品种（P<0.05），第3叶部分3个品种（系）含量差异不显著;由此提示，不同茶树品种（系）对花色苷的富集还与芽叶分化成熟度有关。

2.2 不同部位花色苷富集差异比较

图4显示，茶树紫色芽叶花色苷在第1中富集最多，在第3叶中富集最少，并与其他部位有显著性差异（P第2叶（7.44 mg/g）>芽头（6.91 mg/g）>第3叶（4.46 mg/g），猜测茶树对花色苷的富集可能与叶片基因的表达受叶片成熟度的影响有关。

由表2可知，同一生长季节不同茶树芽叶部位对花色苷的富集能力存在显著差异，其中第1叶富集能力最强，在各生长季节与其他部位均存在显著差异（P<0.05）;各部位的花色苷总量均随生长季节的变化而表现先升后降趋势，其中，第1、2中的花色苷总量随季节变化相对明显，而芽头和第3叶花色苷总量随季节变化不明显，表明茶树不同芽叶部位随生长季节变化而对花色苷的富集差异主要体现在第1、2叶的差异上。

2.3 不同生长季节花色苷富集差异比较

图5表明，茶树在不同生长季节对花色苷富集特性呈现出由春季到夏季缓慢升高，夏末后逐渐降低的变化趋势，说明光照、温度等环境因素的变化对茶树富集花色苷影响较大，这可能是由于光照度、光质、气温、湿度等影响了茶树花色苷代谢途径中相关酶基因的表达，从而使得茶树在夏季对花色苷的富集作用增强。

3 讨论

茶叶花色苷是花青素与糖苷的结合物，其中花青素是由查尔酮合成的，具有多种生物活性，研究茶树对花色苷的富集特性对选育高花色苷茶树品种、高产优质栽培茶树以及开发利用茶叶花色苷具有重要的理论与实践意义[19]。资料表明，植物叶片在不同的发育期对逆境胁迫敏感度不同，且不同叶片花色苷关键代谢酶的表达量和累积量不同[20-21];在茶树花青素合成途径中部分关键酶基因在嫩叶中的表达水平明显高于老叶[22]。本研究发现不同品种（系）、不同部位、不同生长季节茶树中的花色苷总量存在显著差异，与前人研究结果[21-24]相符。3个茶树品种（系）对花色苷的富集能力由强到弱依次为自选9803>安73>红芽佛手，不同部位富集能力由强到弱依次为第1叶>第2叶>芽头>第3叶，同时随着由春末至秋中的季节变化，茶树对花色苷的富集总体上呈现出先上升后下降的趋势，其中，自选9803叶片在夏末花青素含量达到最高值（14.24 mg/g），安73在夏末达到最大值（12.63 mg/g），红芽佛手则在夏初达到最高值（7.33 mg/g），与前人对光照等环境因子调控茶树紫色芽叶的研究结果[23-24]相一致，说明茶树紫色芽叶对花色苷的富集同时受到茶树种质、生长环境、分化发育程度等多种因素的调控。芽头的嫩度最好，但花色苷富集能力却较第1叶弱的原因，有必要后期从茶树芽叶不同部位中花色苷代谢途径关键酶基因层面开展深入研究。另一方面，本研究通过HPLC检测到的7个茶树紫芽花色苷组分尚未作分离鉴定，后续研究可通过应用最新分离纯化技术获得花色苷组分单体，以便进一步探究茶树紫色芽叶花色苷的化学密码。

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