APP下载

库尔勒香梨黑头病病原菌的分离鉴定

2019-09-23欧阳辉张伟达程少波

江苏农业科学 2019年14期
关键词:鉴定致病菌

欧阳辉 张伟达 程少波

摘要:为了分离、鉴定库尔勒香梨黑头病病原菌,并结合形态学和分子生物学等手段对致病菌进行鉴定,采用马铃薯葡萄糖琼脂平板法对致病菌株进行分离纯化,观察病原菌株的菌落特征,通过显微镜观察病原孢子形态特征,并根据回接试验确定其致病性能。结果表明,从病梨萼端表面及香梨生长环境中共分离出11株菌株,综合病原菌菌落形态、孢子显微结构及回接试验,筛选出2株候选菌株(SY-6、XL-6),其回接香梨的病症与正常发病的香梨较相似。通过十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,简称CTAB)法提取病原菌DNA,经rDNA内转录间隔区(ITS-rDNA)基因片段测序及美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,简称NCBI)网站的同源性比对,鉴定得出SY-6、XL-6均属于链格孢属。结果共分离出2株链格孢属病原菌,致病症状与自然发病的香梨较相似,结果与笔者所在课题组的前期研究结果相吻合,从而为研究病原菌致病机制提供了参考。

关键词:库尔勒香梨;黑头病;致病菌;鉴定

中图分类号: S436.612.1+9  文献标志码: A  文章编号:1002-1302(2019)14-0116-04

库尔勒香梨是新疆地区最主要的特色果品之一,由于其皮薄汁丰、品质优良而享誉全国。新疆得天独厚的地理优势和气候条件造就了库尔勒香梨独特的口感和品质,库尔勒香梨果实大小适中,形如纺锤,果皮黄绿,果味浓芬,果肉酥脆爽口,清甜多汁,其含糖量约为10%,含水量约为86%,同时富含多种维生素[1]。库尔勒香梨不但具有很高的食用价值,还有润肺、凉心、消疾、驱毒、切片贴烫火伤止痛不烂等药用功效,深受广大消费者青睐。

近年来,新疆香梨的种植面积及贮藏容量在逐年增加。据统计,截至2016年,新疆香梨种植面积达7万hm2,产量为114万t[2],2016年仅出口产值便达407.62万美元。由于经济价值高、种植面积不断扩增、产量高,香梨的贮藏保鲜成为一个关键问题,经过多年技术攻关,贮藏冷库成为目前果农的一项选择,但是香梨在贮藏过程中容易受到病害影响,例如冻害、病虫害、褐斑病、轮纹病、炭疽病、青霉病、褐腐病及黑头病等[3],这些病害严重降低了商品价值,尤其是库尔勒香梨黑头病,其发病率高达10%,已经成为制约香梨鲜果品质提升的主要问题。2011年,唐文娟等通过对黑头病病原菌致病性的研究发现,其主要侵染特征[4]表现为果实萼端深绿色,且硬度较高;发病初期萼端果皮变黑色,表皮切开后可发现果肉有浅褐色蜂窝状坏死现象,且表观呈现未病变状态的果肉组织略有苦味;发病后期黑头部位稍有塌陷,萼端产生黑色霉层,病斑边缘处果皮变为黑色,病斑与内部好果肉的交界非常明显,呈蜂窝状的黑头病部位在伴随黏稠黑汁状物质产生的同时,存在侵染性腐烂由果皮向果肉逐渐扩散的现象。由于该疾病在香梨貯藏期间高发,同时又严重影响香梨的贮藏品质,所以为了降低香梨发病造成的经济损失,同时避免这种病害长期存在,对黑头病致病菌的研究是非常必要的。

本研究采用分子生物学和形态学相结合的方法对病原菌进行鉴定,以期为香梨黑头病抗病机制的研究及防治提供理论依据,从而降低黑头病发病率,延长香梨贮藏时间,提高香梨品质并促进其产业发展。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本研究所用库尔勒香梨(健康果及病果)均于2016年采自库尔勒市冷藏库及气调库;库尔勒香梨树叶及土壤样本采自新疆生产建设兵团第二师28团香梨果园。

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基[5],购自青岛海博生物技术有限公司;十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,简称CTAB)提取液(200 mL)[6],购自生工生物工程(上海)股份有限公司;DNA纯化试剂盒,购自北京全式金生物技术有限公司;十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS),购自北京博奥拓达科技有限公司;酚-三氯甲烷-异戊醇混合液,购自北京索莱宝科技有限公司;Gold View,购自北京博奥拓达科技有限公司。

LabCycler-PCR扩增仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Thermo Fisher Scientific);QUANTUM ST4全自动凝胶成像仪,北京五洲东方科技发展有限公司;1645056高压电泳仪,北京六一生物科技有限公司;FRESCO 21离心机,赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 菌株的分离纯化及保存

1.2.1 环境中病原菌的筛选 准确称取10.0 g土壤样品,于PDA液体培养基中富集,在摇床上于28 ℃、120 r/min培养48 h,吸取200 μL培养液至PDA固体培养基上,涂布均匀,于28 ℃倒置培养。从梨树枝条上摘取大小形态完整、无明显病态的叶片,用75%乙醇棉球擦拭表面,再用无菌水冲洗3次后自然晾干。用灭菌的打孔器取直径为0.5 cm的叶片切片,放置于PDA固体培养基中,于28 ℃倒置培养。待长出菌落后,将所有菌落采用划线法或点植法转接纯化,直至出现单一稳定的菌落。菌落每次转接均设3组重复。将最终分离的菌落回接未染病香梨进行致病性能的确定。

1.2.2 发病香梨表面病原菌的分离筛选 依据柯赫氏法则[7]从库尔勒香梨的病健相接处切下3处病变组织,在PDA固体培养基上,于28 ℃培养。待长出菌落后,将所有菌落采用划线法或点植法转接纯化5次,直至分离出菌落大小、形状、颜色、表面光滑湿润程度、菌丝生长速度、菌丝形状、产孢情况、孢子颜色、形状等一致的若干菌株[8]。病变香梨样品有15个,每个香梨设3组平行,菌落每次转接均设3组重复。最终将初分离得到的菌落回接到未致病香梨果实上得到致病香梨,进而与未致病香梨比较,进行致病性能的确定。

1.2.3 病原菌的保存 用液体培养法将分离纯化后的致病菌培养至对数期,保存于50%灭菌甘油(用蒸馏水配制)中,于-80 ℃保存。与此同时,将病原菌接种在斜面固体PDA培养基中,培养3 d后,于4 ℃保存备用。

1.3 菌株的形态学鉴定

将已分离纯化的菌种接种在PDA固体培养基平板上,于28 ℃培养,自第4天开始观察菌落的生长状况。病原菌菌落形态:观察分离培养基上病原菌的菌落形态(包括形状、大小、菌落色泽、菌落表面结构、菌落渗出物及菌落边缘特征)。菌落形态特征的描述参照《真菌鉴定手册》[9]《中国真菌志》[10]《植物病原真菌学》[11]及《真菌的形态和分类》[12]。

1.4 回接试验

从气调贮藏库选取健康的库尔勒香梨果实,于室温放置6 h后,在无菌条件下,用75%乙醇棉球表面擦拭消毒,后用无菌水冲洗5次,自然晾干,进行接种。用无菌打孔器在库尔勒香梨萼部分别打3个直径为0.5 cm、深度为0.2 cm的孔用于接种,取相同直径的病原菌饼接种于打孔处,将单果实独立分装于无菌密封袋中,室温存放。用分离出的每个病原菌分别接种香梨果实,每个菌种为1个处理,每个处理重复3次。在25 ℃、相对湿度(RH)保持在90%以上培养5~15 d后对其进行观察,若症状与致病香梨症状一样,则初步确定该菌株为病原菌。

1.5 病原菌分子生物学鉴定

1.5.1 病原菌的DNA提取 采用CTAB法对病原菌DNA进行提取。

1.5.2 PCR扩增病原菌内转录间隔区(ITS区) ITS-rDNA基因片段扩增采用通用引物,上引物为ITSF(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′),下引物为ITSR(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。20 μL PCR扩增体系如下:1 μL DNA模板,0.5 μL 上游引物,0.5 μL下游引物,10 μL预混液Mix,8 μL ddH2O。PCR反应程序如下:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30个循环;72 ℃ 7 min。

反应完成后,取3 μL PCR产物,加1 μL 6×loading buffer,混匀后点样于0.8%琼脂糖凝胶,电泳后在紫外光下观察特异性条带。

1.5.3 PCR扩增产物的纯化回收 PCR扩增产物经全式金琼脂糖回收试剂盒回收纯化。

1.5.4 ITS区基因的克隆转化 将回收纯化产物与T载体(PMD19-T)连接(载体与目的片段摩尔比为1 ∶ 3),然后转化Escherichia coli感受态,筛选阳性克隆[13],进行测序。

1.5.5 质粒提取及测序 筛选阳性克隆,于37 ℃摇床培养12 h,提取大肠杆菌质粒,送相关公司测序。质粒提取步骤参考温建新等的大肠杆菌质粒提取方法[14]。ITS-rDNA测序由北京华大基因研究中心完成。将测序結果在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中进行同源序列比对(BLAST),获得重复率最高的相关属及相关种的基因序列,并根据遗传距离计算结果绘制系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离筛选

以贮藏于冷库的自然发病香梨及生长环境中采集的土壤、树叶为材料,经分离筛选、纯化,得到11株病原菌,其中从土壤中分离出1株(命名为TR-1),从树叶中分离出5株(分别命名为SY-2、SY-3、SY-4、SY-5、SY-6),从病梨中分离出5株(分别命名为XL-2、XL-3、XL-4、XL-5、XL-6)。

通过观察病原菌菌落形态,发现2株菌SY-6、XL-6在生长初期为灰白色,气生菌丝薄层絮状,随着生长时间的延长及孢子的产生,逐渐表现为浅绿色直至褐色,菌落有明显的同心轮纹,中心突起且泛白,质地紧致,呈毡状,表面呈现沟纹状,基底为墨绿色,生长后期培养基呈黑色,菌落边缘处有1道宽约0.2~0.4 cm的白色菌丝体。这与笔者所在课题组前期研究结果,即黑头病病原菌链格孢属的菌落形态较接近,初步判定菌株SY-6、XL-6为链格孢属。

2.2 病原菌的显微观察

通过对菌株进行显微观察,在高倍镜下观察孢子形态,由图1可以看出,SY-6、XL-6病原菌孢子串生、有横隔且孢子呈长卵形,与链格孢属较为相似。

2.3 回接试验

将分离纯化得到的致病菌菌株(SY-6、XL-6)采用有伤回接(菌饼)法进行试验,由图2可知,接种后香梨的发病症状与自然发病香梨相似。2株致病菌于库尔勒香梨上在生长初期为灰白色,气生菌丝薄层絮状,随着生长时间的延长,逐渐变为浅绿色直至褐色,菌落有明显的同心轮纹,中心突起且泛白,质地紧致、毡状,表面呈现沟纹状,基底为墨绿色,生长后期培养基呈黑色,菌落边缘处有1道宽约0.2~0.4 cm的白色菌丝体。初步判定病原菌株SY-6、XL-6为链格孢属。

2.4 黑头病致病菌的分子生物学鉴定

2.4.1 致病菌的DNA提取及扩增 采用CTAB法提取菌株(SY-6、XL-6)的基因组DNA,并进行PCR扩增,以ITSF、ITSR通用引物扩增致病菌的ITS-rDNA,对PCR扩增产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明,PCR扩增产物均有条带,且条带单一,无其他杂带出现,电泳结果见图3,根据电泳图中marker Ⅱ分子量大小的比对可知,致病菌的ITS-rDNA基因序列片段大约为600 bp。

2.4.2 PCR产物回收纯化 将PCR扩增产物经全式金琼脂糖回收试剂盒回收纯化,并进行电泳检测。由图4可以看出,回收结果均有条带,且条带单一,回收效果良好。

2.4.3 克隆转化及质粒提取 将纯化后的DNA由T载体转入大肠杆菌感受态细胞,进行抗生素蓝白选择性培养,成功挑选白色单菌落,于37 ℃摇床培养10~12 h后,提取质粒,质粒提取结果表明,SY-6、XL-6条带清晰明亮,质粒提取较成功,电泳检测结果见图5。

猜你喜欢

鉴定致病菌
重庆园科院研究发现该市香樟煤污病致病菌
SSEL结合多重PCR同时快速检测生菜中4种食源性致病菌
古籍版本鉴定
青铜器鉴定与修复初探
食品中致病菌快速检测方法的探讨
缺血性脑卒中患者龈下菌斑中牙周致病菌检测
《食品中致病菌限量》(GB29921—2013)解析
医院获得性肺炎致病菌耐药性检测分析