潘慧 邓蕾 陈美艳

摘要：浙江省泰顺县周年雨水较多，部分猕猴桃园区由于栽培管理方式不当造成病害严重流行。中国科学院武汉植物园联合泰顺县林业局分别于2016年8月、10月，2017年4月对泰顺县7个乡镇共19个代表性栽培果园进行了猕猴桃周年病害调查。通过采集大量典型病害样本，结合生物学特征、分子鉴定及致病性验证试验进行分析。结果表明，泰顺县猕猴桃夏季和秋冬季主要病害为细菌性溃疡病和真菌性软腐病、黑斑病、灰斑病和炭疽病;春季溃疡病发生率显著升高，但真菌病害轻微很多。调查结果可为泰顺县后期猕猴桃病害的预测及综合防治提供理论依据。

关键词：猕猴桃;病害;生物学特征;ITS鉴定;Psa鉴定

中图分类号： S436.634  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）14-0104-07

猕猴桃（Actinidia spp.）隶属猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia Lindl.），具有很高的营养及经济价值，目前在中国、新西兰、意大利、法国、智利等国家广泛种植[1]。浙江省泰顺县地处温州西南，是我国浙江省第二大猕猴桃主产区，至2017年12月全县发展猕猴桃近930 hm2，年产量约 9 000 t。目前主要在罗阳镇、泗溪镇、三魁镇、司前镇、筱村镇、百丈镇等乡镇种植，品种多数为红阳，其次是布鲁诺和华特，近几年开始逐步发展金艳和Hort16A等品种。

浙江省泰顺县属于亚热带海洋型季风气候，雨量充沛，气候温和湿润，土壤为山区沙质壤土，优越的地理环境为猕猴桃产业的发展提供了保障。但同时猕猴桃生长季节雨水也较多，部分果农栽培管理方式不当，导致园区阴蔽潮湿，造成猕猴桃细菌性及真菌性病害的流行，阻碍了当地猕猴桃产业的发展。因此，中国科学院武汉植物园联合泰顺县林业局于2016年8月、10月，2017年4月对该县7个乡镇19个代表性栽培园区进行了猕猴桃周年病害调查，通过采样分析和病原鉴定，全面了解该县不同季节猕猴桃病害的种类、危害程度及分布，为后期猕猴桃病害的预测及综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 感病样本采集

2016年8月、10月，2017年4月对19个采样点进行感病样本的采集。共采集243份具有明显病斑的叶片，53份果实，25份枝干作为试验材料。各采样点具体地理位置及所采样本品种见表1。

1.2 病原菌的分离和培养

1.2.1 细菌性病原菌的分离和培养 叶片样本用1 cm规格打孔器取病健交界处3片直径1 cm的组织，经75%乙醇表面消毒，置于装有600 μL 10 mmol/L MgSO4和2粒钢珠的 1.5 mL 离心管中，用研磨仪进行匀浆。对于枝干样本，用无菌手术刀切取病健交界处内部组织，同样方法消毒并研磨。将菌悬液进行梯度稀释，取150 μL 10-3菌悬液涂布于假单胞菌专用固体培养基KB CFC，28 ℃培养2 d后划线分离单菌落。挑取生物学特征近似丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）的单菌落进行氧化酶测试，保存阴性菌落。每个样本设置3个重复。

1.2.2 真菌性病原菌的分离和培养 叶片样本用1 cm规格打孔器取病健交界处3片直径1 cm的组织，经75%乙醇表面消毒后置于PDA培養基25 ℃恒温培养5 d。针对果实样本，运用无菌手术刀切取病健交界处果肉组织直接置于PDA培养基25 ℃培养5 d。待平板长出菌落后，选取菌丝尖端置于新PDA平板以获得纯菌株。每个样本设置3个重复。

1.3 病原菌的分子鉴定

1.3.1 细菌性溃疡病病原菌分子鉴定 运用Rees等的方法[2]，用特异引物PsaF1（5′-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3′）和PsaR2（5′-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3′）;扩增反应体系 10 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，含Mg2+的10×PCR buffer 1 μL，100 μmol/L 引物各0.1 μL，5 U/μL Taq酶 0.1 μL，1.1 g/mL 二甲基亚砜（DMSO） 0.2 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 6.3 μL;PCR反应程序为94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环;72 ℃ 10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否有溃疡病菌菌株可扩增得到的大小为280 bp的目的条带。

1.3.2 真菌ITS鉴定 将纯菌株置于平铺玻璃纸的PDA培养基上，25 ℃静置培养5～8 d后收集菌丝。采用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，置于-20 ℃备用。运用真菌核糖体基因组转录间隔区通用引物ITS4/ITS5进行PCR扩增（ITS5序列，GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG;ITS4序列，TCCTCCGCTTATTGATATGC）。扩增反应体系40 μL，10 mmol/L dNTP 0.80 μL，含Mg2+的10×PCR buffer 4.00 μL，100 μmol/L引物各0.20 μL，5 U/μL Taq酶 0.25 μL，1.10 g/mL DMSO 0.80 μL，DNA模板2.00 μL，ddH2O 31.75 μL。PCR反应程序为94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环;72 ℃ 10 min。扩增产物经 1.5% 琼脂糖凝胶检测后送至华大基因公司测序，将测序结果进行Blast比对，作同源性相似度差异性分析，确定菌株的分类地位。

1.4 致病性验证

1.4.1 细菌性病原菌致病性验证 将单菌落置于液体KB培养基中，于28 ℃恒温振荡培养3～4 d，转速为180 r/min。将菌悬液稀释为D600 nm=0.2，喷雾接种20 μL于组培苗叶片上，塑料盖密封保湿48 h，同时接种无菌水为阴性对照，5～6 d 后观察发病情况。接种试验重复3次。待叶片发病后从病健交界处再次分离培养菌落，进行氧化酶测试和分子鉴定。

1.4.2 真菌性病原菌致病性验证 将果实和叶片的表面用2号解剖针刺伤，果实刺伤深度为2～3 mm，将5 mm无菌打孔器制成的菌株菌饼接种于伤口处，菌丝面朝下并覆盖无菌湿棉球，置于透明盒中密封保湿，同时以接种PDA琼脂块为对照，5～8 d后观察发病情况。每个菌株的接种试验重复3次。果实和叶片发病后从病健交界处再次分离培养病原菌，与原接种菌株进行比较。

2 结果与分析

2.1 感病症状

在浙江省泰顺县大部分栽培园区观察到疑似灰斑病、黑斑病、炭疽病、溃疡病和果实软腐病的的症状（图1），感病症状与罗禄怡等描述的[3-7]一致。疑似灰斑病感病症状：叶面病斑呈灰褐至暗褐色，叶背黑褐色。疑似黑斑病感病症状：叶背黑色霉状病斑，病部对应的叶面出现黄色褪绿斑。疑似炭疽病感病症状：叶面病斑中间为灰白色，边缘深褐色，叶缘略向叶背卷缩。疑似溃疡病感病症状：叶面有不规则形褐色斑点，病斑周围伴有3～5 mm明显的黄色晕圈;枝干上乳白色黏质菌脓与植物伤流混合后呈锈红色，顺着枝干流下。疑似软腐病感病症状：剥开发病部位表皮，病部中心果肉呈乳白色，周围呈黄绿色水渍状。

2.2 细菌性溃疡病病原菌的鉴定结果

经鉴定发现，夏季采样点1的叶片样本携带溃疡病病原菌，秋冬季采样点8和14的叶片样本携带溃疡病病原菌，春季发现携带溃疡病病原菌采样点明显增多，包括采样点4、9、10、14、15、18、19（图2）。

2.3 真菌性病原菌的鉴定结果及预测病害

不同季节采样鉴定到的全部真菌菌株列表及预测病害见表2。部分菌株菌落及其孢子形态见图3。小孢拟盘多毛孢菌分生孢子纺锤形或棍棒状，隔膜分成5个细胞，大小为（18.5～22.5） μm×（5.6～7.3） μm;顶孢上着生2～3根长9.2～20.5 μm的无色附属丝。胶孢炭疽菌分生孢子透明圆柱状，单胞，大小为（9.8～14.3） μm×（4.2～5.4） μm。稻黑孢菌和球黑孢菌分生孢子均为黑色圆球形，单胞，大小直径分别为10.8～14.3 μm和12.5～18.0 μm。

2.4 致病性验证

致病力试验测试（图4）表明，接种细菌性病原菌的叶片6 d后出现溃疡病症状;接种真菌菌株的刺伤叶片在6 d左右出现症状，果实刺伤处出现典型软腐症状，叶片和果实的发病部位也重新分离到原接种菌株，符合柯赫氏法则致病性验证。结果显示Psa菌株会导致猕猴桃溃疡病;拟盘多毛孢菌可引

起灰斑病;胶孢炭疽菌会引起炭疽病;球黑孢菌会导致叶斑病。链格孢菌、葡萄座腔菌、间座壳菌、拟盘多毛孢菌均可导致果实软腐病;鉴定为其他病原菌的菌株致病力效果并不十分明显，还有待进一步确认。

3 讨论与结论

浙江省泰顺县猕猴桃产业主要是专业合作社性质，大部分为家庭式种植，栽培范围从海拔100 m以上至800 m以上，各园区普遍存在同时种植早熟、中熟和晚熟多品种的现象，加大了栽培管理难度，从而诱发猕猴桃病害的流行。本次周年病害调查发现，泰顺县猕猴桃夏季和秋冬季主要病害为细菌性溃疡病和真菌性软腐病、黑斑病、灰斑病和炭疽病;春季溃疡病发生率显著升高，但真菌病害輕微很多。

猕猴桃细菌性溃疡病由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种引起，致病性强，病原菌可随风雨进行传播，根除难度较大，目前已成为全球猕猴桃产业发展的主要限制因素。从泰顺县猕猴桃病害的周年检测结果来看，采样点1、4、8、9、10、14、15、18、19已感染细菌性溃疡病，特别是春季溃疡病的整体发病率较上一年夏季和秋冬季明显升高，除采样点5以外，其他果园都有发生，品种从红阳扩展到米良1号、华特和翠玉等。其原因主要有3点：（1）主栽品种红阳溃疡病抗性较差，且泰顺地区2016年冬季低温、2017年早春倒春寒及花期多阴雨，导致溃疡病流行蔓延;（2）部分种植户从网上购买猕猴桃接穗苗木、外地随意引进接穗，极有可能携带溃疡病病原菌;（3）当地各园区种植户对溃疡病认识不足，修剪嫁接前工具未经消毒，且经常在无防护措施的情况下相互参观溃疡病疫区果园，进一步加快了溃疡病的传播。

真菌性病害方面，目前国内外专家已确定导致猕猴桃果实软腐病致病菌有葡萄座腔菌，拟盘多毛孢菌，间座壳菌（拟茎点霉菌的有性态），链格孢菌等[8-14]。同时，拟盘多毛孢菌和胶孢炭疽菌分别会引起灰斑病[15]和炭疽病[16]，球黑孢菌引起猕猴桃叶斑病[17]，稻黑孢菌证实引起黑斑病和褐斑病[18]。此次调查结果，夏季和秋冬季果园均鉴定出大量导致猕猴桃果实软腐病、黑斑病、炭疽病、灰斑病的病原菌，春季在大部分园区并未鉴定到真菌性病害病原菌，比夏季和秋冬季轻微很多。另外，部分分离到的真菌病原菌菌株在致病性验证中，尚未发现引起叶片或果实明显的感病症状，仍需后期进一步验证。泰顺县真菌病害严重，主要原因为（1）该县气候温和，雨量充沛，猕猴桃的生长季雨水较多，且大部分排水沟排水不畅，园区雨后严重积水导致猕猴桃植株根系腐烂，树势较弱;（2）架式不规范，泰顺县仅有少数新果园采用了钢丝、钢缆搭架，大部分园区仍采用传统的毛竹为支柱，毛竹中易潜藏病原菌，导致病害发生;（3）大部分果园杂草丛生，通风透光极差，易造成病害的流行。

目前，对于猕猴桃病害的防治措施主要为农业防治与化学防治相结合，其中防治关键是加强栽培管理，增强树势，落实冬季清园和用药，减少病情基数。根据果农生产经验反馈，化学防治主要为花前施用加瑞农、可杀得3 000和异菌脲等药剂，花后施用嘧菌酯和苯醚甲环唑等药剂。针对细菌性溃疡病，防治关键是秋冬季9—12月施用3～4次氢氧化铜、硫酸链霉素等进行预防保护[19-20]。笔者建议当地负责部门除重视农业防治和化学防治外，应加强种植户消毒防范意识以减少人为传播的发生，同时在高海拔地区种植抗性较好的品种，种苗从当地正规产业部门引进。

笔者所在课题组首次对泰顺县猕猴桃栽培果园常见病害进行了周年调查，确定了当地不同季节的主要病原菌，并预测了潜在可能发生的病害，调查结果将为泰顺县后期结合预测预报形成适合本地的综合防治技术，提高猕猴桃整体生产管理水平奠定理论基础。

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