管彬 周竹青

摘要：以拟南芥野生型（WT）、呼吸暴发氧化酶f（rbohf）突变体、细胞自噬2（atg2）突变体、atg5突变体和转基因GFP-ATG8a为材料，利用遗传学、细胞学手段分析细胞自噬在应答镉胁迫中的作用。结果表明，镉胁迫可以诱导野生型拟南芥根中活性氧（ROS）的积累;镉胁迫诱导野生型拟南芥中自噬相关基因ATG2、ATG5、ATG7和ATG8a的表达以及自噬体的积累。进一步研究表明，在镉胁迫处理后，atg突变体中自噬体的数量与野生型相比明显降低，ROS水平却显著升高。上述结果初步表明，细胞自噬通过调节ROS应答镉胁迫。研究结果为深入研究植物应答镉胁迫的分子机制提供了依据。

关键词：拟南芥;细胞自噬;镉胁迫;活性氧

中图分类号： Q945.78  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）14-0090-06

镉（Cd）是土壤重金属污染的主要元素之一[1]，对植物的生长发育危害较大。在镉胁迫发生时，首先影响植物根系，使线粒体、叶绿体等细胞器发生损伤，造成活性氧（ROS）的大量积累，产生氧化损伤，导致积累损伤蛋白质[2]。ROS是生物体有氧代谢产生的一类活性含氧化合物的总称，主要包括超氧阴离子自由基（ O-2 ·  ）、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）和单线态氧（1O2）等[3]。在正常情况下，植物细胞内ROS的产生与清除处于动态平衡状态，不会造成伤害。但是，环境胁迫能打破植物细胞内ROS的代谢平衡，导致ROS积累。在拟南芥中，ROS的一个重要来源是植物呼吸暴发氧化酶（RBOH），存在10个RBOH基因，分别是AtRBOHA～AtRBOHJ[4]。在镉胁迫下，AtRBOHC、AtRBOHD、AtRBOHF基因调节ROS的代谢[5]。

细胞自噬是一种广泛存在于真核细胞中、利用液泡或溶酶体降解细胞内损伤细胞器和蛋白的过程[6-8]。植物细胞自噬主要分为两类：微自噬和巨自噬（下文涉及的细胞自噬为巨自噬）[9]。微自噬是指液泡膜内陷将底物包裹并降解的过程[10]。巨自噬是细胞接受信号诱导后，在胞内产生新月状或者杯状的自噬泡，包裹需要降解的细胞质和细胞器，形成自噬体并运往液泡降解[11]。目前人们已经在酵母中发现了32个参与细胞自噬过程的基因（ATG），在模式植物拟南芥中，也有超过30个ATG被发现[12]。在自噬体的形成中，有ATG8-PE连接体系和ATG5-12-16连接体系[13]。ATG8-PE连接体系主要负责ATG8与磷脂酰乙醇胺（PE）的类泛素化连接并定位在吞噬体膜上[14]。ATG8-PE从吞噬体膜的起始到被液泡降解，伴随了整个细胞自噬的发生过程，因此ATG8被广泛用作自噬检测的标记蛋白[15]，而ATG5-12-16连接系统有促进ATG8-PE形成的功能[16]。

镉胁迫可以产生氧化损伤，导致ROS和损伤蛋白质的积累[17]。在植物中，ROS可以通过诱导细胞自噬的发生而减少氧化损伤[18]。对野生型拟南芥外源施加ROS的诱导剂甲基紫腈（MV），可以诱导细胞自噬的发生。而用MV处理atg10b突变体后，引起氧化蛋白的大量积累，使其对氧化胁迫更为敏感[19-20]。另外有研究表明，拟南芥atg突变体中的ROS水平明显较野生型中的ROS水平高[21]。ROS作为信号分子可以诱导细胞自噬的发生，从而减少ROS和损伤蛋白质对植物细胞的伤害。因此，有理由相信细胞自噬在镉胁迫中有重要作用。目前，细胞自噬在镉胁迫中的作用仍不清楚。本研究旨在通过遗传学和细胞学手段来研究细胞自噬应答镉胁迫的机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生型拟南芥和atg2、atg5和rbohf突变体种子由笔者所在实验室保存，转基因GFP-ATG8a种子由华南师范大学陈文利教授惠赠。所有种子均经1%次氯酸钠溶液表面消毒 12 min 后，用无菌水冲洗4～5遍，置于4 ℃冰箱3 d，然后点种在1/2 MS培养基上，垂直斜放在光—暗周期为16 h—8 h、光照度为120 μmol/（L·m2·s）、温度为22 ℃、相对湿度为60%的培养箱内。

1.2 镉胁迫处理

本试验于2017年在华中农业大学生命科学技术学院细胞生物学实验室进行。选择在人工气候培养箱中正常生长 5 d 左右的拟南芥，分别转移至氯化镉浓度为0、25、50 μmol/L 的MS培养基中进行镉胁迫处理。转移好后用封口膜封口，于22 ℃培养箱内处理2 d，测量拟南芥野生型和突变体的根长（n=20），设3次生物学重复，记录数据。

1.3 自噬体观察

将用GFP（绿色荧光蛋白）-ATG8e标记的拟南芥植株放于载玻片上，小心夹取，摆放端正，滴1滴蒸馏水于载玻片上，缓慢向下压片，使细胞分布相对均匀。使用徕卡倒置共聚焦显微镜（Leica SP8）的40×或20×水镜或光镜观察拟南芥根的GFP荧光信号。GFP的激发波长为488 nm，发射波长为507 nm。

单丹磺酰尸胺（MDC）染色：将拟南芥完全浸入 50 μmol/L MDC染液（Sigma-Aldrich）中，于37 ℃染色 10 min，然后用磷酸緩冲盐溶液（PBS）冲洗3次。使用激光共聚焦显微镜（Leica SP8）的40×水镜加上4′，6-二脒基-2- 苯基吲哚（DAPI）滤镜观察拟南芥根的MDC激发的荧光信号。MDC的激发波长为380 nm，发射波长为530 nm。

1.4 活性氧的检测

用特异性ROS荧光探针2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）观察内源性ROS的水平。将拟南芥完全浸入10 μmol/L DCFH-DA染液（Sigma-Aldrich）中，于37 ℃染色处理30 min，然后用PBS冲洗3次。使用倒置激光共聚焦显微镜（Leica SP8）的20×干镜观察拟南芥根的DCFH-DA激发的荧光信号。DCFH-DA的激发波长为488 nm，发射波长为605 nm。主要在相同参数设置下和相同gain值（用来表示荧光强度）下拍照。用Image pro plus 6.0测量其相对荧光强度。

1.5 RT-PCR分析

将新鲜的拟南芥组织用液氮研磨成粉末，用TRIzol抽提总RNA，最后将总RNA溶于焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，简称DEPC）水中。用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser试剂盒将分离的RNA反转录成cDNA。使用TaKaRa公司的SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行荧光定量PCR扩增，每组试验设3次技术重复和3次生物学重复。反应程序如下：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。试验结果用2-ΔΔCT进行分析，以ACTIN2基因作为内参基因，荧光定量PCR反应的引物序列见表1。

1.6 数据分析

除了特别说明，所有试验都重复3次及以上，本研究结果都以“x±s”表示。试验数据采用Graphpad prism 7.0软件的双尾t检验进行分析。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 镉胁迫诱导活性氧的积累

为了研究ROS是否参与镉胁迫，笔者利用ROS特异性探针DCFH-DA检测镉胁迫处理后野生型拟南芥根中ROS的变化。DCFH-DA染色结果显示，镉胁迫处理后的ROS含量在拟南芥根中明显升高（图1-A）。对3组重复试验进行统计分析，发现用25、50 μmol/L CdCl2处理后的ROS含量分别是对照的1.33、2.37倍（图1-B），这表明镉胁迫诱导了ROS的产生。由于RBOHF基因参与了镉胁迫下过氧化氢的产生，而过氧化氢是ROS的一种[5]。为了获取ROS参与镉胁迫的遗传学证据，对野生型和rbohf突变体进行镉胁迫处理。表型分析结果表明，生长在正常MS培养基上的野生型和rbohf突变体植株的表型没有明显差异;但是在添加 50 μmol/L CdCl2的MS培养基上处理2 d后，rbohf突变体的主根明显比野生型的短（图1-C）。根长的统计结果表明，用50 μmol/L CdCl2处理后，rbohf突变体的根长比野生型的减少了38%（图1-D），这表明rbohf突变体对镉胁迫敏感。

2.2 镉胁迫诱导细胞自噬的发生

为了研究细胞自噬是否参与拟南芥的镉胁迫，对CdCl2处理浓度分别为25、50 μmol/L的拟南芥进行取样，利用荧光定量PCR技术检测ATG2、ATG5、ATG7、ATG8a基因的相对表达水平。结果表明，镉胁迫处理后，细胞自噬相关基因的相对表达水平明显上升（图2）。用25 μmol/L CdCl2处理后，ATG2、ATG5、ATG7、ATG8a基因的表达量分别是对照组的 2.04、3.40、2.81、5.82倍;用50 μmol/L CdCl2处理后，ATG2、ATG5、ATG7、ATG8a基因的表达量分别是对照组的3.93、7.76、 4.19、 12.86倍。 这些结果表明， 镉胁迫诱导了细胞自噬基因的表达。为了进一步验证上述结果，利用转基因 GFP-ATG8a 幼苗来观察自噬体。将用25、50 μmol/L CdCl2处理和正常条件下生长的植株直接放置在激光共聚焦显微镜下进行观察。结果表明，镉胁迫处理后的拟南芥根中有较多GFP-ATG8a标记的点状或环状的自噬体积累，而在对照中较少（图3-A）。对3组重复试验进行统计分析，发现用25、50 μmol/L CdCl2处理后的自噬体数分别是对照的8.89、13.32 倍（图3-B）。

2.3 atg突变体对镉胁迫敏感的表现

为了研究细胞自噬在镉胁迫中的作用，用50 μmol/L CdCl2处理拟南芥野生型或细胞自噬突变体植株。结果表明，生长在正常MS培养基上的野生型和atg突变体植株的表型没有明显差异;但是在添加50 μmol/L CdCl2的MS培养基上处理2 d后，atg突变体的主根明显比野生型短（图4-A）。这表明atg突变体对镉胁迫敏感。根长统计结果表明，镉胁迫处理后，atg2、atg5突变体的根长分别比野生型减少了18%、28%（图4-B）。为了进一步研究细胞自噬在镉胁迫中的功能，对用50 μmol/L CdCl2处理的拟南芥野生型或细胞自噬突变体植株进行MDC染色。图像分析结果表明，在正常MS培养基上生长时，野生型和atg突变体中的自噬体较少。用镉胁迫处理后，野生型植株中的点状或环状结构自噬体数明显增加，而atg突变体中的自噬体数没有明显变化（图4-C）。3组重复试验的统计结果表明，用50 μmol/L CdCl2处理后，野生型拟南芥中的自噬体数是对照的10.5倍，而atg突变体的自噬体数没有明显变化（图4-D）。上述结果表明，atg突变体对镉胁迫敏感。

2.4 atg突变体在镉胁迫下活性氧的积累

为了研究细胞自噬与ROS的关系，用DCFH-DA检测50 μmol/L CdCl2处理后，野生型、atg2和atg5幼苗中的ROS水平变化。染色结果显示，在正常MS培养基上生长时，atg2、atg5突变体中的ROS含量与野生型没有明顯差异。在遭受镉胁迫处理后，野生型、atg2、atg5幼苗中的ROS含量明显升高，atg2、atg5突变体中的ROS水平比野生型的高（图5-A）。3组重复试验的统计结果表明，用50 μmol/L CdCl2处理后，atg2、atg5突变体中的ROS含量分别比野生型的高2.40、2.29倍（图5-B），这说明细胞自噬可以通过调控植物ROS的产生来应答镉胁迫。

3 结论与讨论

镉是一种重金属污染物，可以影响植物的生长发育[22-23]。当镉胁迫发生时，植物会发生一系列生理生化改变来抵抗镉胁迫[2]。ROS作为一种重要的信号分子，参与应答各种非生物胁迫。镉胁迫使植物产生氧化损伤，促使ROS积累[17]。本研究结果表明，镉胁迫处理后拟南芥根尖积累了大量的ROS。另外，由于RBOH是模式植物拟南芥ROS的最主要来源[5]，通过观察rbohf突变体的表型发现，rbohf突变体对镉胁迫敏感。这表明RBOHF可能参与镉胁迫下ROS的产生。

细胞自噬在植物的生长发育和营养胁迫、氧化胁迫等胁迫中发挥着重要作用[24]。在植物中，细胞自噬能被非生物胁迫包括饥饿、氧化和渗透胁迫诱导[25]。同酵母一样，烟草悬浮细胞在营养缺乏的条件下也能够激活细胞自噬。对其进行饥饿处理会引起自噬相关基因ATG4a、ATG4b、ATG8a、ATG8i、ATG3、ATG7的表达水平升高[26]。本研究结果表明，镉胁迫诱导细胞自噬相关基因ATG2、ATG5、ATG7、ATG8a的表达。进一步观察ATG8a-GFP转基因植株，发现镉胁迫处理后诱导了大量自噬体产生。这些结果表明，细胞自噬参与应答植物的镉胁迫。另外，有研究表明，拟南芥atg7、atg9、atg4a4b、atg5、atg18a突变体对营养缺乏敏感[27]。笔者发现，atg2、atg5突变体在镉胁迫下的生长被抑制，自噬体的形成减少，进一步说明细胞自噬在植物的镉胁迫过程中发挥着重要的作用。干旱和渗透胁迫都可以造成植物细胞ROS的氧化蛋白的积累，而细胞自噬有清除氧化蛋白和ROS的能力[20]。本研究发现，镉胁迫处理后，atg2、atg5突变体中的ROS含量都比野生型的高，說明细胞自噬可以清除细胞内的ROS。综上表明，细胞自噬可能通过清除细胞内的ROS来抵抗镉胁迫。

由于植物的镉胁迫机制十分复杂，植物镉胁迫中的许多问题仍未有解答。本研究为作物在镉胁迫下的耐受性研究提供了理论依据，而关于细胞自噬在镉胁迫中的作用还有待进一步研究。

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