王凯 王凯琪 常裕

摘要：为建立南泥湾野生山丹丹快繁和植株再生系统，并进一步为山丹丹试管内育种提供材料，以南泥湾林场后场采集到的野生山丹丹的鳞茎为材料，研究不同浓度6-BA对南泥湾野生山丹丹启动培养的影响、不同6-BA与IBA浓度组合对其继代培养的影响、IBA浓度对其组培苗生根的影响，并对生根苗进行了炼苗移栽。结果表明，（1）南泥湾野生山丹丹启动培养的较佳培养基为MS+白砂糖30 g/L+琼脂5.5 g/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L+活性炭 0.2 g/L，9 d转绿，21 d分化出了小鳞茎，分化率为84%;（2）较佳继代培养基为MS+白砂糖30 g/L+琼脂 5.5 g/L+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，培养25 d后，繁殖率（繁殖系数）为7.3;（3）较佳生根培养基为1/2 MS+白砂糖30 g/L+琼脂5.5 g/L+IBA 0.3 mg/L，培养25 d后，生根率为84%，以上培养基pH值均为6.8。用生根培养的山丹丹组培苗炼苗移栽成活率达到了100%。

关键词：野生山丹丹;鳞茎;组织培养;植株再生;6-BA

中图分类号： S682.2+90.4+3  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）14-0059-03

山丹丹，學名山丹（Lilium pumilum DC.），为百合科百合属多年生球根花卉。山丹丹鳞茎含淀粉，供食用，也可入药，有滋补强壮、止咳祛痰、利尿等功效。花鲜红色，下垂。山丹丹是一种抗寒性很强的优良的百合属种质资源，可用于培育抗寒耐旱的百合花品种[1-2]。南泥湾野生山丹丹（图1）种质是延安大学山丹丹大学生创业团队2013—2015年在南泥湾林场进行种质资源调查时发现的。南泥湾野生山丹丹种质相较于劳山种质有花色为橙红色、上仰的特异性。山丹丹在自然状态下繁殖系数小，人们对其保护意识不强、过度采挖以及生态环境的变化，导致野生山丹品质退化严重、数量稀少。

组织培养技术可以有效提高山丹丹繁殖效率、改善品质退化等。目前，已经建立山丹丹离体快繁再生体系，并对山丹丹组培苗的继代培养、生根培养及移栽条件进行研究[3-5]。陕北地区山丹丹组培快繁研究仅有劳山山区的种质[6]，南泥湾种质并无报道。我们采用组培快繁的方法对南泥湾野生山丹丹进行快速大量繁殖，以期建立南泥湾野生山丹丹快繁和植株再生系统，解决该种质数量稀少的问题，并进一步为山丹丹试管内育种提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为2015年5月采自陕西省延安市宝塔区南泥湾林场后场的8颗野生山丹丹鳞茎。

1.2 方法

1.2.1 启动培养 将鳞茎外层腐烂鳞片剥除，鳞盘朝上用自来水冲洗2 min，用吸水纸吸干表面水分，放入超净工作台备用。再将启动培养基、接种工具、0.1% HgCl2、吐温20以及75%无水乙醇放入超净工作台备用，打开紫外灯和空气快速杀菌消毒机（型号：LH-2000）灭菌30 min之后，在超净工作台上将鳞片剥下，用75%无水乙醇将鳞片浸泡30 s，无菌水清洗1 min。转入0.1% HgCl2加1滴吐温20，振荡8 min，无菌水清洗3次，每次2 min，再用无菌滤纸吸干表面水分后的鳞片接种于启动培养基上。每瓶接种1个鳞片，每个激素水平接种13瓶。先散光培养7 d，防止其失水褐化，后转入光下培养。培养室温度设置在（25±2） ℃，光照时间12 h/d，光照度（1 500±200） lx，相对湿度60%～75%。

启动培养基为：MS基本培养基+白砂糖30 g/L+琼脂5.5 g/L，pH值为6.8。6-BA浓度为0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L共4个水平，并加入NAA 0.01 mg/L和活性炭2 mg/L。

1.2.2 继代培养 将初代培养中诱导出的小鳞茎，待其芽苗生长、抽出肥绿叶片之后，接入继代培养基上进行培养，每瓶接入1个小鳞茎，每处理接10瓶，以30 d为1个培养周期。培养温度（24±2） ℃，光照时间12 h/d，光照度（1 500±200） lx，相对湿度60%～75%。

继代培养基为：MS基本培养基+白砂糖30 g/L+琼脂5.5 g/L，pH值为6.8。使用6-BA浓度0.8、1.0、1.2、1.4 mg/L 共4个水平，IBA浓度0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L共4个水平的2因素4水平试验。

1.2.3 生根培养 挑选生长健壮、无污染的继代苗转接进生根培养基，避光培养7 d后转入光下培养。生根培养基：1/2 MS+白砂糖30 g/L+琼脂5.5 g/L，pH值为6.8，IBA浓度为0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L共4个水平。培养温度 （24±2） ℃，光照时间12 h/d，光照度（1 500±200） lx，相对湿度60%～75%。

2 结果与分析

2.1 不同浓度6-BA对山丹丹启动培养的影响

接种后4个浓度处理的污染率分别为0%、7%、0%、7%（表1），均可满足试验需求。鳞片在启动培养基上9 d左右呈现出转绿情况，14 d左右边缘呈现白色颗粒状突起，21 d左右突起的部分分化出小鳞茎（图2），随后不断长出叶片。每个鳞片上分化出了4～8个小鳞茎。启动培养中统计结果（表1）表明，不同浓度6-BA的培养基中，鳞片的分化情况不同，总体为先升高后降低。转绿率，6-BA浓度为 1.0 mg/L 时最高，1.5 mg/L时次之，0.1 mg/L 时最低。出芽率，当6-BA在1.0 mg/L浓度时最高，1.5 mg/L浓度时次之，0.1 mg/L时最低。所以认为在 6-BA浓度为1.0 mg/L时对南泥湾地区山丹丹启动培养效果好。

2.2 6-BA与IBA对山丹丹继代培养的影响

2.2.1 6-BA与IBA组合对继代培养的影响 继代培养 15 d 左右材料均分化出含有鳞片的叶（图3），25 d时统计新生出芽数（以2叶片中间所夹的生长点为准），增殖系数见表2，不同处理下增殖系数呈现出不同的变化。F6处理下新生芽数最多，为73个，增殖系数达到最大，为7.3。其次为F7处理，新生芽有69个，增殖系数为6.90。再其次为F5处理，新生芽有52个，增殖系数为5.2。最差的是F1处理，只分化出3个新芽，增殖系数也只有0.30。可见F6处理下即6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L的6-BA与IBA组合较其他组合更有利于南泥湾地区山丹丹组培的继代培养。

2.2.2 6-BA与IBA各自对继代培养的影响 在不同培养基中，随着6-BA浓度的增大，增值系数先增加后减小，在 6-BA 浓度为 1.0 mg/L 时达到最大值， 为 5.70。 随着IBA的浓度增大，增值系数在0.2 mg/L时达到最大，为2.90。这2种外源激素对继代培养的方差分析结果见表3，6-BA的F值为23.92，大于临界值F0.05，所以6-BA的影响达到显著水平;IBA的F值为0.18，未达显著水平。

2.3 IBA浓度对山丹丹组培苗生根的影响

将继代培养获得的组培苗接种在IBA浓度不同的生根培养基上，10 d观察到山丹丹鳞片基部有乳白色颗粒状的愈伤组织形成，然后分化出根（图4）。25 d后统计结果见表4，显示所有IBA浓度下都有根生成，且IBA浓度对生根率、根长、生根条数和根的形态有影响。在IBA浓度为 0.3 mg/L 的水平下生根率达到最高，为84%，平均根长达到3.22 cm，平均根数5.3条，均优于其他3个水平;根的形态为基部膨大、端部细长。

3 炼苗移栽

3.1 炼苗

用高锰酸钾溶液对栽培工具浸泡消毒。将生根培养获得的组培苗挑选长出5～7张叶子、叶片最低高度达5 cm、生根数达5条以上、根长达到4 cm以上的生根苗进行炼苗。先将生根苗连同培养瓶一起置于移栽设施中放置7 d，然后打开瓶口再放置2～3 d。

3.2 移栽

将炼苗后成活的生根苗取出，清洗掉多余的培养基，定植在营养钵内，每个营养钵装栽培基质100 g，栽种1株生根试管苗（图5）。移栽后每7 d浇1/2MS大量营养液1次。空气湿度保持在80%～90%，遮光率50%，光照度（1 000±500） lx ，环境温度控制在22～26 ℃。移栽过程每天观察植株的生长情况，在小苗管理期间要经常喷水，防止烂根。每隔2～3周追1次稀薄液体肥料，定期喷洒杀菌剂，预防病害发生。经2个月的管理，待小苗长出5对以上新叶后即为移栽成活。调查结果表明，成活率为100%。

4 讨论与结论

启动培养是否成功与外植体选择有很大关系。马永红等认为，以山丹丹器官作为外植体时分化能力由大到小为种子>鳞片>幼嫩茎段>叶片[7]。鉴于鳞片诱导不受季节因素影响，本次试验选用南泥湾野生山丹丹鳞片进行诱导，发芽率达84%。鳞片易于诱导、繁殖系数高，但其后期污染率较高，要及时转入新的培养基。刘冬云等筛选适合山丹丹的启动培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L[8-9]。本试验筛选的启动培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L，其中差异可能由材料的生态类型引起，还有待进一步研究。影响山丹丹生长发育的重要因素之一是植物生长调节剂的种类和浓度。van Aartrijk等认为，低浓度生长素和高浓度细胞分裂素的组合对百合鳞片分化有促进作用[10]。本试验筛选出有利于南泥湾山丹丹继代培养的外源激素浓度为1.0 mg/L 6-BA与浓度为0.2 mg/L的IBA组合，验证了该结论。本试验继代培养中，对不定芽的增殖有决定性作用的是细胞分裂素，而生长素对不定芽叶片的生长分化有至关重要的影响。高浓度6-BA、低浓度IBA的培养基易于分化不定芽，而在一定的IBA浓度范围内，增殖的芽数随着6-BA浓度的提高而增长，但芽之间变得越发紧凑，适当增加IBA的浓度，不定芽叶片伸张，鳞茎也有所膨大。誘导生根一般需要降低无机盐浓度，常使用低浓度的MS培养基[11]，本次使用1/2MS诱导出了根，但生根培养基中IBA浓度不宜过高，否则会产生愈伤组织，再在愈伤组织下面生出根，这样的根容易掉落，不利于移栽。

以南泥湾野生山丹丹的鳞茎进行组培快繁得出以下结论：较佳启动培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L+AC 2 mg/L，此时出芽率达到84%;较佳继代培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，增殖系数达到7.3;较佳生根培养基为1/2MS+IBA 0.3 mg/L，生根率为84%。以上培养基均附加白砂糖30 g/L、琼脂5.5 g/L，pH值均为6.8。用继代培养的山丹丹组培苗炼苗移栽成活率达到100%。

参考文献：

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