刘玲 陈祥平 范小敏

摘要：为了建立经济稳定的桑树简单重复序列（SSR）-PCR反应体系，为SSR分子标记在桑树研究中更广泛地应用提供试验基础，采用L16（45）正交试验设计和单因素试验，对桑树SSR-PCR反应体系中的模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和rTaq酶用量5个因素的4个水平进行优化分析，并比较这5个因素的不同浓度对扩增效果的影响。结果表明，各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为Mg2+、dNTPs>引物>模板DNA>rTaq酶。研究最终确立了最佳反应体系，即在10 μL反应体系中，含有1.5 μL 10～20 ng/μL DNA模板、0.4 μL 25 mmol/L Mg2+、0.5 μL 2 mmol/L dNTPs、各0.15 μL 20 μmol/L正反向引物、0.1 μL 5 U/μL rTaq酶和1 μL 10×loading buffer。通过稳定性检测，表明该体系能够用于桑树的SSR分析。

关键词：桑树;正交试验设计;单因素试验;SSR-PCR反应体系优化

中图分类号： S888.2  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）14-0045-05

桑树是桑科（Moraceae）桑属（Morus L.）的多年生木本植物，是重要的经济植物，桑叶是家蚕的主要饲料。我国地域辽阔，生态环境各异，经过长期的自然选择和人工选育，形成了非常丰富的桑树种质资源。因此，研究桑树的遗传多样性及其亲缘关系对桑树的栽培育种、良种选育等有重要意义。

简单重复序列（simple sequence repeats，简称SSR）DNA，又稱微卫星DNA（microsatellite DNA），是由Moore和Terer等于1991年提出的，它是以1～6 bp核苷酸为重复单位而多次串联重复组成的DNA序列。SSR具有多态性高、试验操作简单、共显性等优点，被广泛应用于植物的分子连锁图谱构建、基因定位、品种遗传多样性和群体结构分析、纯度鉴定、杂种优势的预测等[1]。

SSR是一种基于PCR技术的分子标记，试验结果易受反应组分的影响，为了确保试验结果的准确性和重复性，建立和优化SSR-PCR反应体系是非常必要的。目前，应用SSR分子标记研究桑树种质资源遗传多样性等方面的报道较少，关于桑树SSR-PCR反应体系优化的研究仅见罗义维等报道的采用正交设计试验的优化过程[2]。本研究参考已有的桑树SSR研究[2-7]，采用正交试验和单因素优化试验结合的方法，对桑树SSR-PCR反应体系中的模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶5个因素的4个水平进行优化分析，以期建立经济、实用、稳定的反应体系，为SSR分子标记在桑树研究中更广泛地应用提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验材料采自四川省丝绸科学研究院桑树种质资源圃，详见表1。选择桑树品种丰台作为体系优化用的DNA模板。引物序列参照Aggarwal等的研究[8-10]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，详见表2。PCR反应所用的Mg2+、dNTPs、rTaq酶、DNA marker和10×loading buffer均购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 桑树总DNA提取及质量检测 桑叶总DNA采用2种方法从用0.15 g硅胶干燥的桑叶中提取，一种是稍加改进的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[11]，另一种是在用4×CTAB提取前，先用去糖缓冲液抽提。取3 μL提取的DNA样品，在1%琼脂糖凝胶中电泳20 min，电泳完毕后在WFH-201B紫外反射透射仪中观察DNA条带。利用KAIAO K5500微量紫外分光光度计检测DNA浓度，之后于-20 ℃保存。

1.2.2 PCR扩增及产物的电泳检测 PCR反应在Thermal Cycler（上海山富科学仪器有限公司生产）上进行。PCR反应体系总体积为10 μL，包括Mg2+、dNTPs、rTaq聚合酶、正反向引物、模板DNA和10×loading buffer。PCR反应程序参照赵卫国的报道[12]，采用降落PCR：95 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，63 ℃退火1 min，每个循环降低0.5 ℃，72 ℃延伸 1 min，16个循环;94 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，24个循环;72 ℃延伸5 min。反应结束后控制温度在 10 ℃。

将扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测。进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，在DYY-6C型稳压稳流电泳仪上，于200～220 V预电泳10～20 min。预电泳完毕，垂直平稳地拔出凝胶中的梳子，上样10 μL（3 μL ddH2O，3 μL 6×loading buffer，4 μL PCR产物），上样完毕后，在 120 V 电压下电泳，待溴酚蓝指示剂跑到下层琼脂糖封口处时停止电泳，用时大约为1 h 40 min。采用银染法（1.0 g/L AgNO3）染色，并在显色液（在200 mL蒸馏水中加4 g NaOH、0.08 g Na2CO3和0.8 mL甲醛）中显色3～5 min至电泳条带清晰可见，用数码相机拍照并保存图片。

1.2.3 SSR-PCR反应体系的建立及优化 对于PCR反应体系中的5个因素（模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和rTaq酶用量），每个因素分别设置4个水平，详见表3。

1.2.3.1 正交试验 采用L16（45）正交设计，共16个反应体系（表4）。除表4中的变化因素外，每管还含有1 μL 10×buffer，引物为Mulstr-l，每个反应体系设2次重复。

1.2.3.2 单因素试验 根据正交试验确定的最佳反应体系，依次优化Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、rTaq酶用量和模板DNA浓度5个单因素，每个水平设2次重复。当其中1个因素水平变化时，体系中其他成分的水平保持不变。

1.2.4 退火温度的优化 以确定的最佳反应体系为基础，以提取的丰台DNA作为模板，对引物Mulstr-l的退火温度进行优化筛选，设定退火温度范围为（55±63） ℃，根据PCR仪自动生成的12个温度梯度进行PCR扩增，扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

1.2.5 最佳反应体系稳定性检测及应用 选择2个桑树材料嘉陵16号、乐山花桑，选择2对引物，对优化出的反应体系进行稳定性检测，每个样品、每对引物设4个重复。选择4对引物，用优化得到的反应体系，以7份桑树DNA为模板进行SSR扩增。

2 结果与分析

2.1 桑树基因组DNA的提取结果

如图1所示，采用4×CTAB法提取桑树总DNA的结果显示，点样孔明亮，说明有糖类等杂质，并且部分材料拖尾比较严重;而在加入提取液之前加入去糖缓冲液得到的DNA，点样孔没有杂质污染，只有轻微拖尾，说明去糖缓冲液能够有效去除桑叶中的多糖等杂质，提取得到的DNA更纯，能够满足SSR试验要求。

2.2 SSR-PCR优化反应体系的直观分析

由SSR-PCR正交试验结果（图2）可以看出，16个反应体系的扩增结果差异明显。第1、6、14、15组合存在非特异性扩增条带，且目的条带扩增不完全;第2、9、11、16组合的扩增结果不稳定，2次重复扩增出的条带不一致，且有非特异性扩增条带;第5组合条带清晰，但是目的条带扩增不完全;第4、7、8、10、12、13组合的目的条带扩增完全，但是第8、12组合的背景较深，第10、13组合2个重复中1个重复的目的条带较浅;第4、7组合的目的条带扩增完全、清晰、重复性好。综合每组的2个重复，以及從经济节约的角度考虑，选择第7组合为最优体系，即10 μL反应体系中，含有1.5 μL 10～20 ng/μL DNA模板，各0.20 μL 20 μmol/L正反向引物，1.0 μL 25 mmol/L Mg2+，0.5 μL 2 mmol/L dNTPs，0.20 μL 5 U/μL rTaq酶和1 μL 10×loading buffer，用ddH2O补至10 μL。

为了进一步证明对试验结果初步判断的准确性，根据李志勇等的方法[13]对正交设计试验中的各组分浓度组合进行分析，结果见表5，其中k值代表某因子在某水平下参与反应所产生的扩增条带数的平均值。在本研究中，5个因素在设定的4个水平下对结果的影响由大到小依次为Mg2+、dNTPs浓度>引物浓度>模板DNA浓度>rTaq酶用量。

k值反映了影响因素各水平对反应体系的影响情况，k值越大，反应水平越好。模板DNA浓度以1水平最好，引物浓度以4水平最好，Mg2+浓度以3水平最好，dNTPs浓度以1、2水平最好，rTaq酶用量以3、4水平最好。因此可见，桑树 SSR-PCR的最佳反应体系为1 ng/μL模板DNA+0.5 μmol/L 引物+ 2 mmol/L Mg2++0.10 或 0.15 mmol/LdNTPs+0.15或0.2 U/μL rTaq酶。综合分析第4、7、8、12组合试验设计中每个因素的水平和实际扩增效果，认为第8组合每个因素的水平与理论值最接近，因此，分别以第7、8组反应体系为基础进行单因素优化试验。

2.3 单因素优化的结果分析

以第8组合为基础进行单因素优化试验，结果显示，电泳图背景深，主带不明显，无法读带（图略）。说明理论得出的最佳体系的效果需要进一步检验优化，同时也反映理论与实际存在一定的差距。

以第7组合为基础，进行单因素优化。如图3所示，当模板DNA浓度为2.5 ng/μL时，目的条带扩增不完全;当模板DNA浓度为1.0、2.0 ng/μL时，2个重复的扩增结果不稳定。综合4种浓度的电泳结果，选择1.5 ng/μL作为模板DNA的最佳浓度。当引物浓度为0.2、0.4 μmol/L时，扩增结果不稳定;当引物浓度为0.5 μmol/L时，电泳背景较深;当引物浓度为0.3 μmol/L时，有清晰的目的条带。因此，确定引物的最佳浓度为0.3 μmol/L。当Mg2+浓度大于1.5 mmol/L时，扩增不稳定;当Mg2+浓度为1.0、1.5 mmol/L时，都能扩增出明显的条带;但当Mg2+浓度为1.5 mmol/L时的背景较深，所以选择1.0 mmol/L为Mg2+的最佳浓度。当dNTPs浓度为0.15、0.20 mmol/L时，条带扩增不稳定;当dNTPs浓度为0.10、0.25 mmol/L时，都有清晰的目的条带。从经济节约角度考虑，选择0.1 mmol/L为dNTPs的最佳浓度。当rTaq酶用量为0.15、0.2 U/μL时，存在非特异性扩增;当rTaq酶用量为0.05 U/μL时，目的条带清晰且重复性好，因此确定rTaq酶的最佳用量为0.05 U/μL。

以上结果表明，正交设计能够考虑各因素间的交互作用，单因素试验可以对反应体系中每个因素的不同水平进行直观分析[14]。与正交试验相比，在单因素试验中，除了模板DNA浓度、dNTPs浓度相同外，引物浓度、Mg2+浓度和酶用量都有所降低。综合2种试验结果，确定在10 μL桑树SSR-PCR反应体系中，5个因素分别为1.5 ng/μL模板DNA，各 0.3 μmol/L 正、反向引物，1.0 mmol/L Mg2+，0.1 mmol/L dNTPs，0.05 U/μL rTaq酶。

2.4 最适退火温度的确定

如图4所示，在不同退火温度下，扩增效果存在差异。退火温度为55.0、56.6、57.5 ℃时，都能扩增出目的条带;退火温度为55.8 ℃时，2个重复出现扩增不稳定的情况;退火温度高于58.5 ℃时，扩增的条带数减少，PCR产物量较低。从主带清晰度及背景深浅来考虑，引物Mulstr-l的退火温度选择56.6 ℃为宜。因此，引物Mulstr-1优化后的PCR反应程序如下：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s，56.6 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸60 s，37个循环;72 ℃延伸5 min，反应结束后保存在10 ℃。

2.5 最佳反应体系的稳定性检验及其应用

用2个桑树材料嘉陵16号、乐山花桑，选择MulSTR5、Mulstr-l这2对引物，对优化出的反应体系进行稳定性检验，每个样品、每对引物设4次重复。由图5可以看出，2个样品的4次重复都能够稳定地扩增出明显的条带，说明该优化体系稳定可靠。

采用MulSTR5、MulSTR4、Mul3SSR197和Mul3SSR183这4对引物，利用优化后的SSR-PCR反应体系，对7份桑树种质进行扩增。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示，这4对引物都获得了清晰的条带（图6），表明该反应体系的特异性、可重复操作性和稳定性较好。

3 讨论与结论

桑树是我国重要的经济作物，优化并建立适合桑树的SSR-PCR反应体系，是SSR标记在桑树中应用的重要基础。目前对SSR-PCR体系優化的方法有单因素设计和正交设计等。正交设计能够分析因素间的交互作用，但是由于其试验体系较小，受到的试验操作误差较大，而且也不能顾及个别因素的影响，而单因素试验正好能够弥补正交试验的不足[15]。本研究通过综合考虑正交试验和单因素优化试验的方法，对PCR反应中的5个因素进行优化，得到桑树SSR-PCR最优反应体系，即10 μL反应体系中，含有1.5 μL 10～20 ng/μL模板DNA，0.4 μL 25 mmol/L Mg2+，0.5 μL 2 mmol/L dNTPs，各0.15 μL 20 μmol/L正反向引物，0.1 μL 5 U/μL rTaq酶和1 μL 10×loading buffer。通过稳定性检验，证明该反应体系稳定、可靠，为今后SSR在桑树领域更广泛的应用提供了相应支持。

PCR反应体系中各组分的浓度会对扩增效果产生影响。Mg2+浓度过低时，会降低DNA聚合酶的活性;Mg2+浓度过高时，会降低扩增的特异性。dNTPs浓度过低时，产物条带模糊不清;dNTPs浓度过高时时，会出现非特异性扩增。引物用量过少时，产物量过低;用量过多时，会产生非特异性产物和引物二聚体。DNA聚合酶的用量直接决定PCR反应的结果，用量过高时，容易产生非特异性扩增产物;用量过低时，则会导致目的条带合成量减少。模板DNA浓度也会影响扩增效果，在彭波等的研究中，模板浓度达到了2.5 ng/μL[3-4]，而本试验结果表明，模板DNA的量并非越大，扩增效果越好，在设定的4个浓度中，前2个浓度1.0、1.5 ng/μL的扩增效果较后2个浓度的好。罗义维等的研究表明，模板DNA的浓度与本研究结果相当，可见适当降低模板的浓度能得到相对清晰的条带[2，6]。在本研究得到的最佳反应体系中，每个因素的浓度与罗义维等的研究结果[2]相比，除了模板DNA的浓度差异不大外，其余4个因素的浓度均低于后者，出现这种现象的原因可能是研究方法、目的、试验材料、引物、技术要求不同造成的。

除了以上5种因素会影响PCR扩增效果外，引物退火温度也是1个关键因素。退火温度过高时，模板与引物退火反应缓慢而不准确;退火温度过低时，则会产生引物二聚体和杂带[16]。不同引物的退火温度需要摸索才能确定，本研究只优化筛选了引物Mulstr-l的退火温度，为56.6 ℃。当采用多个引物同时扩增时，反应程序可采用降落PCR方法。降落PCR能够避免或有效降低由反应体系内主要组分浓度过高或过低、引物序列较短、退火温度过高或过低、模板DNA复杂等因素引起的非特异性产物的产生[17]，并且省去了摸索引物退火温度的繁琐步骤，从而大大缩短了试验时间。

综上所述，在SSR-PCR扩增中，应综合考虑各反应组分的浓度和引物退火温度，才能得到有效的扩增条带，从而增强结果的真实性。

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