杨宇平，许 良，徐春娜，蒲首丞，孙梅好

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

茶作为一种健康自然饮品，受到人们的欢迎，白茶是轻发酵茶类，是我国特有品种[1]。安吉白茶是一种自然突变绿茶，是我国的珍稀茶树品种，安吉白茶中富含大量具有生理功能的物质，如茶多酚和茶多糖[2-3]。茶多糖是一类复合多糖，易溶解在热水中，几乎不溶于有机溶剂，但在高温和较强的酸碱环境中容易降解导致生物学活性丧失[4-5]。近年来研究发现，茶多糖是茶叶中又一种具有重要生理活性的物质，拥有防治心血管疾病[6]、抗氧化[7]、抗肿瘤[8]、降血糖[9]及免疫调节[10]等多种功能。安吉白茶在医学、养生上有较高的价值，对其成分的研究尤其是茶多糖的研究有着广阔的前景[11]。故而一种简单、高效的茶多糖提取方法对于茶多糖的研究具有十

分重要的作用。现阶段，国内外对茶多糖的提取方法主要有热水浸提法、酶提取法、超声波辅助提取法、超临界CO2提取法等[4，12]。其中，运用了超声波空化效应的超声波辅助提取法[12]具有耗时短、反应条件相对温和、能耗低和效率高的特点。而蒽酮-硫酸法等这类间接检测多糖的方法，因具有操作简便、实用性较强等优势而被广泛运用[13]。

对于茶多糖提取的具体条件，已经有很多学者进行了研究。陈朝银等[14]通过试验发现，随着料液比的增大，茶多糖得率呈升高的趋势；当料液比达到1∶30（g/mL）后，升高趋势变缓慢；当料液比大于1∶40（g/mL）时，就不再发生明显的变化。周宇波等[15]研究结果表明，随着料液比的增大，茶多糖的提取得率先增加后减少，且在料液比1∶20（g/mL）时得率最高，达到108.45 mg/g。细胞中物质浸出方式包括简单扩散和受细胞膜结构控制的主动转运。由于多糖主要以简单扩散的方式进出细胞，所以，溶剂量的增大可以提高浓度差的推动力，从而加快其溶出。但是同时要考虑到，细胞中其他物质溶出的概率也相应变大，将会降低茶多糖提取得率。而且料液比越大，后期离心、过滤等处理步骤损失的茶多糖含量就越大。同时过多的溶剂也会对后续纯化步骤带来较多不便。尚进等[16]研究结果表明，在逐步延长超声时间的条件下，茶多糖得率也跟着上升，并在120 min 时达到最高，之后茶多糖得率又逐渐下降。周宇波等[15]研究结果表明，随着提取时间的延长，茶多糖得率先略有上升再下降，在60 min的条件下得率最高，可以达到109.75 mg/g，之后增加提取时间反而会导致得率下降。黄杰等[17]在进行单因素研究的试验中发现，茶多糖的提取得率随着超声时间的增加而呈升高趋势，没有出现提取得率降低的情况，可能与所处环境温度相对比较低有关。李碧婵等[18]研究发现，在提取过程的开始阶段，茶多糖的得率随着超声时间的延长而升高，在60 min 之后，随着浸提时间的增加茶多糖得率反而下降。

本试验以明后老安吉白茶叶为原料提取茶多糖这一生理活性物质，通过响应面试验优化提取工艺，选用ABTS 法检测茶多糖的抗氧化能力，再利用红外光谱法检测茶多糖的结构，研究超声波辅助提取茶多糖的工艺，使之应用于茶饮等相关抗氧化产品中，从而提高粗老茶叶的应用价值。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为明后安吉白茶叶，茶叶于60 ℃烘干后，粉碎备用。

1.2 试剂与仪器

分析纯2，2′- 联氨- 双-3- 乙基苯并噻唑啉-6- 磺酸（ABTS）；浓硫酸、蒽酮、过硫酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾均为分析纯。

UV2550 型紫外- 可见分光光度计（Shimadzu Corporation（Kyoto Japan））；KQ2200DB 型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；Centrifuge 5810R 型离心机eppendof（New Brunswick）；京制00000246 号电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；WB-2000 型水浴锅（杭州庚雨仪器有限公司）；C21-RT2123 型电磁炉（广东省美的生活电器制造有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 多糖含量的测定 选择蒽酮- 硫酸比色法[19]对白茶中的多糖含量进行检测。葡萄糖标准曲线的绘制：准确称取100 mg 葡萄糖溶解在蒸馏水中，然后将溶液定容至1 000 mL，配制为0.1 mg/mL 的葡萄糖标准液。另准确称取0.05 g 蒽酮和量取25 mL浓硫酸，在烧杯中缓慢混合均匀，配成蒽酮试剂（在30 min 内使用）。准确量取葡萄糖标准液（0.1 mg/mL）0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置于试管中，各加入一定量的蒸馏水使每只试管内液体总体积为1.0 mL，稀释后各溶液的浓度分别为0，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL。再分别往每只试管内加入3.0 mL 配制好的蒽酮试剂，将试管内液体充分混匀，放置在沸水浴中加热7 min 使之充分反应，迅速冷却后于620 nm 处测出每一组的吸光值。以葡萄糖溶液的浓度（C）作为横坐标、吸光度值（A）作为纵坐标，得到葡萄糖标准曲线：A＝9.147 6C＋0.040 6（R2＝0.991 2）。

1.3.2 茶多糖基本提取工艺流程 白茶→烘干→粉碎→热水浸提→超声波辅助浸提→定容至50 mL→离心（7 000 r/min，5 min）→过滤，得上清液→滤液浓缩→加无水乙醇沉淀→离心取沉淀→无水乙醇洗涤→干燥→白茶粗多糖。

1.3.3 茶多糖提取得率的计算 其计算公式如下。

其中，Y 为茶多糖的提取得率（%）；c 为基于葡萄糖标准曲线而计算出的样品中茶多糖的浓度（mg/mL）；n 为稀释倍数；V 为溶液体积（mL）；m 为称取的白茶质量（g）。

1.3.4 单因素试验 准确称取0.5 g 白茶粉，90 ℃蒸馏水作为溶剂，研究料液比（1∶20，1∶40，1∶60，1∶80（g/mL））、超声时间（30，60，90，120 min）和提取次数（1，2，3，4 次）对茶多糖提取得率的影响。

1.3.5 响应面优化试验 基于单因素试验结果，分别以料液比（A）、超声时间（B）和提取次数（C）为自变量，将白茶多糖提取得率（Y）作为响应值。基于Box-Behnken 中心组合试验原理，设计3 因素3 水平响应面分析试验。试验因素及水平如表1 所示。

表1 Box-Behnken 试验因素水平

1.3.6 茶多糖抗氧化活性测定 选择清除ABTS+自由基法检测白茶多糖的抗氧化能力。

ABTS+储备液的配制：配制2.45 mmol/L K2S2O8溶液，将ABTS 溶于该K2S2O8溶液中，配制成7 mmol/L ABTS+储备液。将其在常温的暗室中静置12～16 h。该储备液需在3～4 d 内使用有效。

ABTS+测定液的配制：用磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH 值7.4）缓慢稀释ABTS+储备液，并不断检测混合液的吸光度，使其在734 nm 波长处达到0.700±0.020。

抗氧化能力测定：精确量取样品待测液0，10，20，30，40，50 μL，蒸馏水定容至50 μL。再各加入4 mL ABTS+测定液。每只试管均振荡30 s 后，立即检测在734 nm 处的吸光度[20]。

1.3.7 茶多糖结构检测 利用红外光谱法对白茶粗多糖的结构进行分析。

将提取到的茶多糖研磨粉碎，在真空干燥箱中50 ℃干燥至恒质量，自然冷却，KBr 压片制样，在400～4 000 cm-1波数范围进行红外检测。

1.4 数据处理

采用Excel 2010 和OriginPro 8 作图，运用Design-Expert 8.0 建立响应面模型，优化试验结果的参数，作统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 茶多糖得率与料液比的关系 由图1 可知，随着溶剂量的增加，白茶多糖提取得率整体呈先升高后下降的趋势。料液比在1∶20～1∶60（g/mL）时，提取得率显著递增，在1∶60（g/mL）时，提取得率达到最高，此时继续增加溶剂量，提取得率出现下降趋势。

2.1.2 茶多糖得率与超声时间的关系 由图2 可知，茶多糖的提取得率和超声时间之间存在密切关系。超声时间为30～90 min 时，白茶多糖得率随时间的增加呈升高趋势，并且在90 min 时得率最高。此时若继续延长提取时间，得率反而降低。

2.1.3 茶多糖得率与提取次数的关系 由图3 可知，在一定范围内，茶多糖提取得率受到提取次数较大的影响，提取次数越多，茶多糖提取得率越高。提取1 次与2 次相比，提取得率明显升高，当提取次数达到3 次时，茶多糖得率达到4.24%，所以，提取次数的增加可以较为有效地增加茶多糖的提取得率。但是从图3 可以发现，当提取次数继续增加，达到3 次或4 次时，提取得率的升高速度逐渐变慢。从实际生产成本考虑，提取次数每增加一次就会引起人力、物力等生产成本的急剧增加，因此，提取3 次为较优水平，可进行下一步优化分析。

2.2 响应面工艺的优化

2.2.1 响应面试验方案及方差分析 选用响应面法优化提取工艺[21]。3 个自变量分别为料液比（A）、超声时间（B）和提取次数（C），响应值为白茶多糖提取得率（Y）。试验的方案和结果列于表2。

使用Design-Expert 8.0 软件，选择其中的Box-Behnken 选项，对表2 中的数据进行多元回归拟合，获得白茶多糖提取得率（Y）与三大自变量——料液比（A）、超声时间（B）和提取次数（C）的二元多项回归方程。统计分析表2 显示的结果，可得到因子最终方程如下。

对上述二元回归方程的分析，具体结果如表3所示。从表3 可以看出，回归方程中C 对白茶多糖提取得率的影响极显著，C2对提取得率影响显著，其他不显著，表明相对于料液比跟提取时间，提取次数（C）对白茶多糖提取得率影响最大。根据方程各变量系数的大小可知，3 个因素中对提取得率的影响程度最大的是提取次数（C），其次是料液比（A）和超声时间（B）。以白茶多糖提取得率为响应值建立的试验模型差异显著（P＝0.022 3），而失拟项P＝0.464 7＞0.05，F 检验结果为不显著，表明本模型对试验拟合度较好。二元回归方程显著，可以较好确定各单因素与响应值之间的关系。因此，白茶多糖提取的最佳优化工艺可利用该方程进行确定[22]。

表2 响应面分析方案及结果

表3 回归方程方差分析

2.2.2 响应面因素分析与优化条件 在响应面分析中，响应曲面的陡度反映了响应值提取得率对于提取条件变化的敏感度，响应面存在最高极值点，说明试验因素的交互作用有最大值[17]。从图4 可以看出，料液比和超声时间之间的响应曲面的陡峭度较小，近似圆形的等高线表明交互作用较小。从图5，6 可以看出，料液比和提取次数、超声时间和提取次数的相互作用的等高线均呈椭圆形，响应曲面的陡峭度较大，说明相互作用较大。比较每2 个因素交互作用的响应面曲张程度可知，超声时间与提取次数的交互项的影响相对其他交互项显著，这与试验的方差分析结果一致（表3）。

利用Design-Expert 8.0 软件，在各因素所选取的范围内进行分析，并结合实际操作的便捷度进行综合考虑后，最终确定白茶多糖的最优提取工艺为：料液比1∶62（g/mL），超声时间94 min，提取次数3 次。此工艺下预测可提取9.7%的茶多糖。用修正后的最佳工艺重复提取3 次以验证预测结果，得到平均值为9.5%，与预测值误差0.2 百分点，说明回归方程的极值分析结果较准确，用响应面法优化白茶多糖提取工艺具有实际应用价值。

2.3 茶多糖抗氧化能力分析

由图7 可知，提取液中的茶多糖对ABTS+自由基表现出较强的清除活性，且该能力与茶多糖质量浓度呈正相关。当茶多糖质量浓度达到0.09 mg/mL左右时，约99%的ABTS+自由基被清除。

2.4 茶多糖红外光谱分析

由图8 可知，在3 270 cm-1处出现一种宽峰，这是糖类物质中O-H 的伸缩振动引起的；在2 930 cm-1处出现的是C-H 的伸缩振动区；在2 000～1 600 cm-1处出现的是C＝O 的伸缩振动区；在1 050 cm-1处出现的是C-O 形成的伸缩振动区。

3 结论与讨论

白茶中茶多糖的高效提取对于茶多糖功能的研究具有重要的意义。本试验研究料液比、超声时间和提取次数与茶多糖提取得率之间的相互作用。基于单因素试验结果，利用响应面法优化提取工艺。综合考虑提取的有效性和茶多糖的稳定性，在研究中超声时间选取90 min 为较优水平。通过响应面分析的方法最终确定最佳提取工艺为：料液比1∶62（g/mL），超声时间94 min，提取次数3 次；以此工艺提取茶多糖，得率预测值为9.7%。在最佳条件下重复3 次，最终取均值9.5%，与模型预测值仅相差0.2 百分点。可见选择响应面试验优化得到的提取工艺参数在准确度和可靠性上都较高，有较好的实用价值。相较于其他试验，如刘畅等[23]对安吉白茶多糖提取工艺的优化，本研究不但将热水浸提的温度从85 ℃提高到了90 ℃还考虑到了提取次数对于得率的影响，并且在增加提取次数的情况下成功提高了茶多糖的提取得率。选用清除ABTS+自由基法检测白茶提取液中茶多糖的抗氧化能力，结果表明，茶多糖对ABTS+表现出较强的清除能力，并且与茶多糖质量浓度呈正相关，当茶多糖质量浓度达到0.09 mg/mL 时，ABTS+清除率可达到99%。