肖正俊，阿良，李洪秋，邓纯博

（沈阳医学院附属中心医院 骨外2 科，辽宁 沈阳 110024）

目前，国内外有三种方法治疗骨缺损[1，2]，具体如下：⑴自体骨移植、异体骨移植和异种骨移植。但自体移植存在供区来源有限，且对供区造成损伤，给患者带来一定的痛苦；异体和异种骨移植会引起免疫排斥反应和传播疾病等并发症；⑵骨延长术[3-5]在延长骨的同时也有利于缺损软组织的修复，显示了其在治疗创伤性复杂骨缺损的优越性。治疗周期长，患者活动不便，可能发生针道感染、松动及断裂等是该项技术的主要不足；⑶诱导膜技术（Masquelet 技术）[6-8]为大段骨缺损治疗带来了新的曙光，其存在治疗周期长和二次手术的缺点。我们拟定利用羊膜构建组织工程骨膜，体外检测其可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

实验动物：成年家兔2 只，用于分离培养骨髓间充质干细胞和建立家兔大段骨缺损研究模型，沈阳医学院附属中心医院实验中心提供。健康人羊膜：由沈阳医学院附属中心医院产科提供。

1.2 实验器材

冷冻干燥机（英国LANCD 型号）；纯水机（法国Millipore）；Ph 计（美国 Orion）；超低温冰箱（日本SANYO）；微量移液枪（美国 Sigma）；水浴箱（中国苏州柏西瓦尔）；培养板（美国Costar）；台式离心机（美国Sigma）；漩涡振荡器（中国北京优晟）；超净工作台（中国上海祺享智能科技有限公司）；电子天秤（中国北京西杰）；照相显微镜（日本Olympus）；倒置显微镜（日本Olympus）；CO2培养箱（美国Thermo Forma）；扫描电镜（SEM）（荷兰 QUANTA200 Philips）。

1.3 实验方法

1.3.1 家兔的骨髓间充质干细胞的分离培养及传代

首先在无菌条件下应用剪刀和镊子分离出家兔的胫骨，去除肌肉等软组织，用5 mL 注射器抽取培养基冲洗骨髓，制成单细胞悬液。调节离心机每分钟1 200 转持续5 min 后，弃上清液。选取含有L-DMEM及10%FBS 混合悬细胞，接种到25 cm2的培养瓶中，温度为37℃、含5%CO2的培养箱中，间隔2～3 d 更换培养液，于倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及附壁情况，4～6 d 细胞80%～90%相融合。细胞传代时，倒弃培养液，PBS 缓冲液清洗3 次，加入0.1%EDTA-Na2与0.25%胰酶消化液约2 mL，用力均匀摇动培养瓶，使细胞表面均有消化液漫过，2～4 min 后，镜下观察细胞变形回缩，弃消化液，滴入血清培养基，用吸管轻轻吹打附于细胞的管壁，细胞悬液就此形成。根据计数板上计出细胞数的多少，将细胞悬液按 1∶2.5 用含 L-DMEM 及 10% FBS 稀释至4～6 mL，接种到25 cm2的培养瓶中，并置于温度为37℃、含5%CO2的培养箱中，进行传代培养并于显微镜下观察，重复上述方法并传至第三代家兔的骨髓间充质干细胞[9]。

1.3.2 家兔骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化鉴定

取第三代家兔骨髓间充质干细胞约2～3×104个细胞/孔密度接种在6 空板血盖片中，H-DMEM 完全培养基24 h 后换作成骨诱导液，每2～4 天换液一次，第4 周行钙结节茜素红染色。用PBS 缓冲液冲洗2～3 次，75%乙醇固定12 min，双蒸水冲洗4 次；0.1%茜素红Tris-HCL37℃，30 min；蒸馏水冲洗、干燥、快干胶封片[10]，显微镜下观察并采图。

1.3.3 人脱细胞羊膜的取材、处理及保存方法

⑴人脱细胞羊膜的取材与处理[11]：胎盘与胎儿分离后立即取胎盘置于无菌盒中，无菌条件下用生理盐水冲洗净胎盘上的血凝块，通过羊膜与绒毛膜间的潜在间隙钝性分离获取羊膜，用无菌PBS 缓冲液洗净羊膜残留组织与血块等杂质，抗生素生理盐水（含庆大霉素1 000u/mL、两性霉素B 2.5 μg/mL）浸泡 20 min，0.25%胰酶消化 24 h，PBS 缓冲液冲洗 4～5 次。将人脱细胞羊膜平铺于无菌滤纸片上，上皮面朝上，剪成20 mm×20 mm 小块，随机分成三组备用。

⑵人脱细胞羊膜的保存方法[12]：将人脱细胞羊膜连同滤纸片按下述方法保存，使用前用无菌PBS缓冲液浸泡15 min。

方法一：Hank’s 平衡盐/ 甘油溶液深低温保存：将人脱细胞羊膜片放入装有4 mL 灭菌Hank’s平衡盐/甘油溶液(Hank’s 平衡盐溶液与甘油体积比为3∶1)的中性硅玻璃瓶中，封闭瓶口，-80℃环境保存，使用前室温自然解冻。此方法保存人脱细胞羊膜6 个月时细胞基本完整和连续。

方法二：纯甘油4℃保存：将人脱细胞羊膜片放入装有4 mL 灭菌纯甘油的中性硅玻璃瓶中，封闭瓶口，4℃冰箱保存。此方法保存人脱细胞羊膜3 个月时细胞就出现严重皱缩形态，结构模糊。

将人脱细胞羊膜固定后行HE 染色，观察细胞是否去除干净；扫描电镜下观察人脱细胞羊膜的结构特征。

⑶家兔骨髓间充质干细胞负载于人脱细胞羊膜上的生长曲线检测：取成年家兔骨髓间充质干细胞第三代，将细胞浓度调整为6×103/mL，种植到48 孔板中，其中24 孔板内为提前浸泡无血清培养基的人脱细胞羊膜，另24 孔板内为提前浸泡无血清培养基的无材料组，每孔各加入0.5 mL 第三代家兔骨髓间充质干细胞悬液。从第二天起，每天相同时间取6孔加入浓度为4 g/L 的四氮唑盐溶液40 μL，约在37℃下孵育4 h，停止培养细胞，弃上清液后，每孔再加入300 μL DMSO，震荡10 min 后，将上清等量吸出到96 孔板中，510 nm 波长测每孔吸光度，并计算6孔的平均值，横轴表示时间，纵轴代表光吸收值，绘制生长曲线。

⑷家兔骨髓间充质干细胞负载于人脱细胞羊膜并成骨诱导培养：消化收集第三代家兔骨髓间充质干细胞，调节离心机每分钟1 200 转离心，调整细胞密度为2×106/mL，使用微量移液器滴加到24 孔板中的人脱细胞羊膜上（大小为1.5 cm×1.5 cm），每片200 μL 均匀涂抹。将培养板在 37℃、5%C02、饱和湿度条件下静置3 h，使细胞附着于人脱细胞羊膜上，再加入1 mL 成骨诱导液 (包含地塞米松8～10 mmol/L，10%胎牛血清，VitC 50 mg/L，高糖 DMEM，β-磷酸甘油钠10 mmol/L)培养，对照组不加入成骨诱导液，每2～4 天更换一次培养液。定期观察及检测对照组及实验组的标本。大体观察：家兔骨髓间充质干细胞负载于人脱细胞羊膜培养后定期从培养孔内生物材料取出，直视下观察加成骨诱导剂及未加成骨诱导剂的复合而成的组织工程骨膜材料的颜色、性状、质地。组织学观察：家兔骨髓间充质干细胞负载于人脱细胞羊膜培养后定期从培养孔内生物材料取出，4%多聚甲醛固定，石蜡块进行包埋，组织学切片，行HE 染色，显微镜下观察组织工程骨膜。扫描电镜(SEM)观察：家兔骨髓间充质干细胞负载于人脱细胞羊膜培养后定期从培养孔内生物材料取出，按照2.5%戊二醛固定，使用酒精脱水，醋酸异戊酯作工作液等步骤，临界点干燥，表面喷金后上机观察家兔骨髓间充质干细胞在人脱细胞羊膜上的黏附、生长、分化、增殖情况。钙结节染色检测(茜素红染色、Von kossa 染色)：家兔骨髓间充质干细胞负载于人脱细胞羊膜复合培养后定期从培养孔内生物材料取出，行钙结节茜素红染色。将标本用PBS 缓冲液冲洗2～3 次，使用75%乙醇固定10 min，再用双蒸水冲洗4～5 次，最后于 37℃下用 0.1%茜素红 Tris-HCl（PH 8.3）30 min 染色；双蒸馏水冲洗、干燥、快干胶封片，显微镜下观察并采集图片。定期取出复合的组织工程骨膜材料后，先使用4%多聚甲醛固定标本，5%硫代硫酸钠孵育30 min，蒸馏水冲洗，然后再使用1%硝酸银溶液紫外线下染色30 min，双蒸馏水冲洗掉细胞表面的黑色物质，最后使用5%硫代硫酸钠染色2 min 及1%中性红复染10 min，双蒸馏水漂洗后观察标本并采集图片。主要观察内容及指标：家兔骨髓间充质干细胞的形态及鉴定。HE 染色及扫描电镜下观察人羊膜脱细胞的结构特点。家兔骨髓间充质干细胞负载于人脱细胞羊膜上的生长曲线的检测（MTT）。HE 染色及扫描电镜下观察家兔骨髓间充质干细胞负载于人脱细胞羊膜上的附着、生长、及增殖情况。

1.4 统计学方法

通过组间F检验其差别。

2 结果

2.1 倒置相差显微镜下观察家兔骨髓间充质干细胞的形态

培养48 h 后细胞开始贴壁生长，出现纤维样细胞形态，大小不一细胞集落逐渐增多，72 h 后基本全部贴壁生长，紧密排列，细胞集落及增生灶不断增加，细胞呈长梭形，其形态发生了本质性的变化。培养3～4 d 后细胞增殖加快，90%左右的细胞开始融合，形成片，并呈现出多变性的体型。一周细胞生长铺满95%的瓶底，平行排列成“螺旋”状或“旋涡”状，细胞核明显、清晰，核浆比例增大。第1～2 代细胞间的贴壁和生长速度无明显区别，呈比原代更均匀的长梭形，细胞间隔更均匀，传至第三代时无明显变化。其中传代1～2 d 为潜伏生长期，3～6 d 为对数增殖期，对数增殖期结束后进入平台期和下降期。如图1-3 所示为家兔骨髓间充质干细胞形态学图片。

图1 原代细胞

图2 第三代细胞

图3 酶处理后的细胞

2.2 家兔骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的检测结果

家兔骨髓间充质干细胞经成骨诱导液培养，显微镜下可见其细胞聚集成团生长，诱导至2 周左右倒置相差显微镜下可见集落生长的细胞群体，呈“旋涡”团状向四周放射生长，形成多个分布不均、大小不一、形态各异的钙素结节，逐渐增大，3 周后被茜素红染成玫瑰红色。图4 所示成骨细胞检测的结果。

2.3 人脱细胞羊膜的观察

经物理及化学等方法处理获得的人脱细胞羊膜呈浅乳白色半透明状膜，冷冻干后的人脱细胞羊膜成白色纸状，其表面略显粗糙。经物理及化学等方法处理获得的人脱细胞羊膜，HE 染色及扫描电镜下观察显示大量的粉红色胶原细胞外基质，呈网状交错分布，没有破坏其结构和成分，未见有细胞形态的结构（图5-7）。

2.4 家兔骨髓间充质干细胞负载于人脱细胞羊膜上的生长曲线

检测家兔骨髓间充质干细胞负载于人脱细胞羊膜（实验组）及无人脱细胞羊膜（对照组）上增殖情况，接种后第2 天细胞开始增殖，第3 天细胞进入快速增长期，前4 d 实验组及对照组细胞增殖速度无统计学意义（F＞0.05）。对照组第5 天达到了细胞增殖的高峰，实验组第7 天细胞达增殖高峰，尔后增殖呈下降趋势。其中第3 天、5 天实验组与对照组增殖细胞量的组间F检验具有统计学意义（F＜0.05），对照组增殖细胞量比实验组少；第5 和第7 天两组增殖细胞量通过组间F检验显示具有统计学意义（P＜0.01），对照组增殖细胞量比实验组少（表1）。

表1 两组增殖细胞的比较

与无人脱细胞羊膜组相比，F＜0.05，具有统计学意义，说明家兔骨髓间充质干细胞可以在人脱细胞羊膜上生长及增殖，比无人脱细胞组的细胞增殖量更多，并且为细胞提供了良好的生长空间及环境。

2.5 家兔骨髓间充质干细胞负载于人脱细胞羊膜并成骨诱导培养

对照组中体外复合培养见家兔骨髓间充质干细胞粘附于人脱细胞羊膜，细胞增殖良好。肉眼观察复合而成的组织工程骨膜材料的颜色和组织硬度不变，并且电镜下观察未见有大量的成骨组织形成。实验组体外复合培养见家兔骨髓间充质干细胞粘附于人脱细胞羊膜，分泌大量的细胞外基质，有大量的细胞分化及增殖。肉眼观察复合复合而成的组织骨膜材料的颜色变白，组织硬度增加，电镜观察见有大量的成骨组织形成。钙结节茜素红染色（+），钙结节Vonkossa 染色（+）（图8，9）。

3 讨论

目前临床已有多种技术修复大段骨缺损，但各种技术都有其局限性，如自体骨移植存在额外手术创伤、骨质吸收、移植骨数量有限、形态不满意、供区并发症等问题；同种异体骨移植存在传播疾病风险；诱导膜技术要求受区有良好的软组织条件，需二次手术取出骨水泥、植入自体松质骨。在大段骨缺损的修复过程中，对局部环境有严格的要求：⑴骨缺损区域的机械稳定环境，如外固定架、髓内针、钢板等固定技术；⑵成骨细胞及多种诱导分子，如β-转化生长因子（TGF-β）、胰岛素样生长因子-Ⅰ、Ⅱ（IGF-Ⅰ，Ⅱ），骨形态发生蛋白（BMP）、成纤维细胞生长因子。在成骨过程中，诱导因子可使聚集的前体细胞定向分化为成骨细胞及血管祖细胞，促进细胞增殖、迁移过程及血管化进程及成骨细胞黏附增殖；⑶阻止缺损处纤维组织长入，如缺损处植骨、骨水泥、钛网、生物膜等。

图4 骨髓间充质干细胞成骨的鉴定

图5 人脱细胞羊膜

图6 HE 染色图片

图7 电镜下观察

图8 BMSCs 与HAAM复合培养5 d

图9 BMSCs 与HAAM 复合培养7 d

骨膜是皮质骨外表面的纤维状血管膜，作为祖细胞的重要贮存之一，在骨形成和再生中起着重要作用。该膜由两层膜组成：包含成纤维细胞的纤维层和包含多能间充质干细胞和成骨细胞的内层。此外骨膜是局部生长因子的来源，如VEGF 和BMP-2，一些体内研究显示，当骨膜被移除时，骨修复受到显著影响。其他研究表明骨膜细胞在自体皮质骨移植物的愈合中具有关键作用，并且骨膜自体移植物可以促进骨折愈合。

羊膜位于胎盘的最内层，多个体外实验已经表明人羊膜具有成骨特性，BMP-2 已经在足月新生儿未分化的人羊膜中被检测到，这种生长因子可诱导间充质干细胞向成骨细胞的分化以及内皮细胞和宿主成骨细胞的增殖和迁移。研究表明，羊膜提取物或羊膜/绒毛膜提取物中含有与成骨有关的生长因子，如成纤维细胞生长因子和转化生长因子，它们可能促进MG-63 细胞的成骨分化。人脱细胞羊膜与家兔骨髓间充质干细胞联合应用时，我们看到大量新生的骨组织，骨组织内可见血管网及不规则髓腔。

骨膜和人羊膜具有若干相似的特征，包括干细胞的存在、生长因子、体外证明的成骨能力，二者都具有渗透性；然而，重要的是要表明骨膜血管化程度很大，而HAAM 是无血管的。一些研究发现骨骼肌（肌动蛋白）分泌的可溶性因子影响骨代谢。肌肉也是促进骨愈合的细胞和生长因子的重要来源。在骨膜处植入人羊膜可作为肌肉-骨骼间的屏障，使肌动蛋白不能在组织之间移动，此外，⑴羊膜通透性良好，允许营养因子及组织液通过；⑵羊膜在骨缺损周围形成机械屏障阻止组织长入；⑶羊膜本身具有干细胞及多种生长因子；⑷羊膜抗原性低，不引起排斥反应；⑸羊膜易于获得，术中操作简单。可见，羊膜本身就是一种良好的生物材料[13]，HAAM 材料属于可吸收胶原类材料，能够作为种子细胞的支架复合构成组织工程骨膜，为临床应用修复骨缺损带来了曙光[14]。

BMSCs 具有多向分化及自我复制的能力[15]，虽是非造血干细胞，但是在应激等一定的条件刺激及诱导下可以分化为成熟的细胞，如软骨及成骨细胞，供临床及科研的应用，并且免疫原性较低。两者相结合，提供适宜的环境，不改变细胞相容性和人脱细胞羊膜原本的特性，置于骨缺损区域诱导成骨的生长。

组织工程骨膜有良好的生物降解性、透明性等特性，作为修复大段骨缺损的材料有其独特的优越性。骨组织工程技术是将种子细胞经过体外培养，复合于支架材料，然后将细胞-支架复合体植入体内骨缺损部位。在诱导分子的作用下，前体细胞聚集、增殖、分化、黏附，进而实现成骨过程。