喻日成， 范元硕， 罗建华

(贵州省人民医院 内分泌科， 贵州 贵阳 550002)

脂肪组织在能量的代谢中具有起重要作用，白色脂肪组织储存甘油三酯、通过脂解后提供脂肪酸，棕色脂肪组织通过激活解偶联蛋白-1(UCP-1)及线粒体β氧化分解脂肪酸提供热量[1-2]。UCP-1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助因子(PGC-1α)在棕色脂肪组织中表达丰富，可作为辅助因子与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)和甲状腺受体β(TRβ)结合、并作用于UCP-1启动子，与肥胖的发生关系密切[3-4]。现代药理研究表明，盐酸小檗碱不仅具有解热、抗炎的作用，还具有改善胰岛素抵抗的作用[5-6]。目前盐酸小檗碱改善胰岛素抵抗的机制尚不明确，本研究观察盐酸小檗碱对肥胖大鼠棕色脂肪组织形态及功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

6周龄Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠24只，初始体质量70～80 g，中南大学湘雅医学院动物中心提供；RNA提取试剂盒(QIAGEN)，逆转录试剂盒(Applied Biosystems)， LightCycler®TaqMan®Master(Roche)，UCP-1一抗(Santa Cruz)，PGC-1α一抗(acam)，辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的二抗(nta Cruz)。

1.2 方法

1.2.1分组 SD雄性大鼠随机分为对照组、高脂喂养组及盐酸小檗碱组，每组8只。对照组大鼠喂基础饲料(蛋白质22%，脂肪12%，碳水化合物66%)、高脂喂养组和盐酸小檗碱组大鼠喂高脂饲料(蛋白质9%，脂肪66%，碳水化合物25%)，6周后盐酸小檗碱组加入200 mg/(kg·d)盐酸小檗碱灌胃，均喂养24周，乙醚麻醉后断头处死，取肩胛部位的棕色脂肪组织保存于-80 ℃用于后续研究，每组取4只大鼠肩胛部位棕色脂肪组织用4%多聚甲醛固定、行常规HE染色。

1.2.2UCP-1 及PGC-1α mRNA表达 (1)总RNA制备，取-80 ℃保存的棕色脂肪组织剪碎，加入TRIzol 1 mL充分匀浆，按QIAGEN试剂盒说明书介绍的方法提取总RNA，采用Nanodrop ND1000 测定RNA的浓度。(2)cDNA合成，按逆转录试剂盒说明书合成cDNA，每个反应体系含RNA 1 μg、10×RT缓冲液2 μL、 dNTP 0.8 μL、随机引物2 μL、逆转录酶1 μL，总反应体系20 μL；反应条件25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，4 ℃后取出样品，-20 ℃保存。(3)PCR扩增，PCR总反应体系10 μL，含cDNA模板2 μL、TaqMan®Master 5 μL、ddH2O 2.5 μL、引物0.5 μL(序列见表1)。PCR反应条件95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 20 s，40个循环， 72 ℃ 5 min。每个qPCR重复3次，以GAPDH作为内参照基因，目的基因的相对表达量通过公式2-ΔΔCt计算。

表1 Real-time PCR引物Tab.1 Real-time PCR primers

1.2.3UCP-1、PGC-1α蛋白表达 (1)大鼠棕色脂肪组织总蛋白提取，取-80 ℃保存的大鼠棕色脂肪组织适量，加入RIPA裂解液1 mL，充分匀浆后提取总蛋白，通过BCA方法测量蛋白浓度。(2)检测UCP-1、PGC-1α蛋白表达，将蛋白样品40 μg加入10% SDS-PAGE点样孔，100 V电压电泳2 h，凝胶转PVDF膜，5%的脱脂牛奶封闭，UCP-1、PGC-1α及β-actin一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，加辣根过氧化物酶酶标记的二抗常温下30 min，TBST洗3次；化学发光法显影、定影，将胶片进行扫描拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠肩胛棕色脂肪组织HE染色

光镜下可见对照组大鼠肩胛间棕色脂肪组织内的细胞小而均匀，高脂喂养组大鼠棕色脂肪组织内的细胞大小不一，结构紊乱，盐酸小檗碱组的棕色脂肪细胞排列较高脂喂养组整齐，细胞大小较均匀。见图1。

2.2 大鼠肩胛棕色脂肪组织UCP-1、PGC-1α基因表达

Real Time RT-PCR及Western Blot结果显示，高脂喂养组大鼠肩胛棕色脂肪组织UCP-1、PGC-1α基因表达水平显著低于对照组，而盐酸小檗碱组UCP-1、PGC-1α基因表达水平较高脂模型组明显上调(P<0.05)。见图2。

对照组 高脂喂养组 盐酸小檗碱组图1 各组大鼠肩胛棕色脂肪组织学(HE，×400)Fig.1 HE staining of scapula brown adipose tissue of rats each group under light microscope

注：1为对照组，2为高脂喂养组，3为盐酸小檗碱组；(1)与对照组比较P<0.05，(2)与高脂喂养组比较P<0.05。图2 大鼠肩胛棕色脂肪组织UCP-1、PGC-1α基因表达Fig.2 Expression of UCP-1 and PGC-1α genes in brown adipose tissue of scapula in rats

3 讨论

肥胖的发病机制复杂，研究发现脂肪组织的功能与肥胖的发生密切相关。棕色脂肪组织由棕色脂肪细胞及血管构成，含有丰富的线粒体，受交感神经支配，既往认为人类的棕色脂肪组织只存在新生儿阶段，但新近研究发现在成年人中亦存在有功能的棕色脂肪组织[7]。棕色脂肪组织线粒体内膜上UCP-1表达丰富，通过氧化脂肪酸产热，在寒冷环境中维持体温、或消耗机体摄取的过多能量，维持体内能量代谢平衡[8-9]。PGC-1α是能量代谢途径中众多转录因子的共激活因子，能诱导棕色脂肪组织中UCP-1的高表达[10]。本研究结果表明，高脂喂养的大鼠肩胛部位的棕色脂肪组织的结构发生明显的改变，细胞大小不一、排解紊乱，而且高脂喂养的大鼠肩胛部位的脂肪组织UCP-1、PGC-1αmRNA和UCP-1、PGC-1α蛋白表达明显下调，因此推测棕色脂肪组织的结构及功能的改变与大鼠的肥胖发生相关。

有研究表明，UCP-1基因敲除小鼠易发生高脂饮食诱导的肥胖、并出现肥胖相关代谢紊乱如胰岛素抵抗和高脂血症[11]。现代药理研究表明小檗碱具有改善胰岛素抵抗、纠正脂质紊乱，促进胰岛素分泌等作用，认为小檗碱可能通过调节类固醇结合元件结合蛋白、PPAR-γ等基因的转录从而改善糖尿病仓鼠的胰岛素抵抗[12]，还有研究发现小檗碱能激活能量代谢感应器AMPK，启动脂肪酸氧化和糖酵解，改善胰岛素抵抗[13]；亦有认为UCP-1、PGC-1α基因的表达增加与能量消耗密切相关[14]。目前国内外尚未见有关小檗碱对棕色脂肪组织UCP-1、PGC-1α基因的表达影响的相关报道，本研究结果发现盐酸小檗碱能改善高脂喂养大鼠肩胛棕色脂肪组织的结构紊乱，推测这种改变可能与盐酸小檗碱提高大鼠肩胛棕色脂肪组织UCP-1、PGC-1α的表达有关，但其具体机制有待于进一步的研究。

综上，盐酸小檗碱具有抗炎，调节能量代谢，纠正脂代谢紊乱等多重作用，其通过影响肥胖大鼠棕色脂肪组织的结构及功能改善肥胖大鼠的胰岛素抵抗，为其在临床中的应用提供了一定的理论依据。