刘若男 朱黎 刘堂荣 邹旋 许哲 管华诗

摘 要：利用酶催化反应，结合在线SPE/液相色谱质谱联用分析系统，建立了一种通过定量酶反应过程测定生物效价的分析方法，用于评价肝素类药物抗IIa因子效价和抗Xa因子效价。本方法采用在线C18柱富集纯化样品后，在另一根C18柱上，以水乙腈体系为流动相进行分离，并采用电喷雾正离子模式，以多反应检测（MRM）方式进行定量分析。方法学考察结果表明，酶反应产物对硝基苯胺（pNA）在3～1000 μg/L浓度范围内线性关系良好，方法的定量限为3 μg/L，准确度（相对回收率）为88.8%～100.6%，日内与日间精密度（相对标准偏差）分别为1.1%～5.4%（n=6）和3.8%～10.9%（n=18），无明显基质效应。以肝素钠标准品为对照品，测定了2个肝素钠供试品的生物效价，均达到药典标准要求。本方法较紫外分光光度法具有更好的灵敏度和良好的重现性，酶试剂及底物用量更少，可作为测定肝素类药物生物效价的新方法，为肝素类药物生产过程中的质量控制提供技术支持。

关键词：质谱; 生物效价; 肝素; 在线固相萃取; 高效液相色谱

1 引 言

肝素（Heparin，HP）为硫酸糖胺聚糖类天然抗凝剂，具有预防血栓形成的作用[1]。尽管肝素在皮下给药后能快速抗凝，而且相对便宜，但由于治疗窗窄、长期使用产生血小板减少症等限制，使得HP临床使用时必须依据患者的凝血功能指导用药[2]。虽然研究者已深入探究了肝素结构和生物活性的关系[3～5]，但由于肝素抗凝活性的结构基础尚未完全揭示，因此，生物效价的测定成为肝素类药物质量评估的重要指标，用于反映肝素类药物的抗凝活性[6]。目前，肝素活性主要通过测定活化部分凝血活酶时间（APTT）、激活凝血时间（ACT）和凝血酶原时间/国际标准化比率（PT/INR）等指标反映[7]。这些传统的抗凝活性测定方法灵敏度较低，仪器、试剂和操作人员的变化都会对结果产生影响。相较于传统凝血测试，血栓弹力图（TEG）[8，9]和凝血活酶生成测定（TGT）[10]在监测肝素活性时灵敏度更高。目前，TEG各监测指标的参考值尚未完全统一，仪器之间的差距较大，需要针对不同分析仪设定基线值[11]。TGT测定则缺乏标准化操作流程和评估指南。血栓形成测试以血块生长速率表征凝血程度，为抗凝检测提供了标准化的测试方法[12]。以上这些方法均需要使用血浆等可能引入误差的生物制品，给出的是多种抗凝反应的综合结果，无法对实际造成凝血障碍和出血副作用的主要病理机制进行确认[13]。近年来，一些医疗机构尝试通过测定单个凝血因子的抗凝活性监测肝素类药物用药[14，15]。现行2015版《中国药典》二部中肝素钠的效价测定采用紫外可见分光光度法，针对单一凝血因子效价（抗IIa因子和抗Xa因子效价）进行分别测定[16]。药典方法需要使用大量价格昂贵的试剂，如各类酶制剂，导致测试成本较高。此外，样品基质的干扰对该方法的结果准确性影响较大。鉴于此，有研究者采用熒光法取代紫外法[17，18]， 提高了检测灵敏度，避免了样品背景的干扰，但在高浓度时，无法避免自身荧光的影响。

测定效价过程用到的试剂较多，成分复杂，为了排除背景基质的干扰，可以通过引入各种分离技术进行效价测定，如体积排阻色谱等[19]。但是，进行色谱分析前必需进行必要的样品前处理操作，从复杂样品基质中提取、净化、分离和富集目标物，提高检测结果的准确性和可靠性，防止污染分析仪器。传统的样品前处理方法多采用离线方式，如液液萃取、固相萃取（SPE）、QuEChERs法等，大多步骤繁琐、费时费力，溶剂消耗大。在线固相萃取是类似于二维液相色谱的样品前处理方法，通过柱切换分别进行样品纯化和分离分析，实现了全自动前处理，减少了分析时间及溶剂消耗，并避免人为因素引起的误差，有效提高了检测的准确性。在线SPE/液相色谱质谱联用系统一般包括两个独立的色谱泵，6位/10位柱切换阀及在线SPE柱和分析柱。近来，在线固相萃取技术在生物医药、食品和环境领域的应用已多有报道[20～24]。

肝素主要的抗凝作用是通过增强抗凝血酶III（AT Ⅲ）这类丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性以及酶抑制剂复合物的稳定性而实现的。肝素糖链与AT Ⅲ的结合会引起AT Ⅲ局部构象发生改变，从而与凝血因子特别是凝血酶（IIa因子，FIIa）和凝血因子Xa（Xa因子，FXa）结合，形成HPATIIIIIa因子及HPATIIIXa因子三元复合物，抑制凝血因子的功能，起到抗凝的效果。此时，游离的IIa因子和Xa因子仍具有活性，可以水解其相应的特异底物[25]。本研究利用在线SPE/液相色谱质谱联用分析系统，通过定量IIa因子和Xa因子参与催化的酶反应过程测定生物效价，不需要使用血浆等生物制品，符合国际上尽可能用理化分析方法代替生物测定的趋势。本方法可用于肝素类药物抗IIa因子效价和抗Xa因子效价的检定，为生产和临床使用中肝素的质量评估提供了新方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

1290 Infinity Value Drive（G1170）二位十通阀、1260 Infinity II泵和1290 Infinity II6460 Triple Quad UHPLC/MS 高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪（美国Agilent公司）; Spectra MAX190 型酶标仪（美国 Molecular Devices 公司）; Thermo Micro 21R低温超速离心机（美国Thermo公司）; HWS12型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）; 十万分之一天平（梅特勒托利多集团）; pH 4000 基础酸度计（上海安莱立斯仪器科技有限公司）; 涡旋混合器（德国艾卡公司）。

IIa因子（EC 3.4.21.5; 5 IU/mg）、Xa因子（EC 3.4.21.6; 0.25 IU/mg）、抗凝血酶III（1 IU/mg）、显色底物S2238和S2765（北京艾德豪克国际科技有限公司）; 肝素钠标准品： 批号150509200912，标示效价为 197 IU/mg（中国食品药品检定研究院）; 肝素钠供试品（东营天东生化工业有限公司）; 三羟甲基氨基甲烷（Tris）、对硝基苯胺（pNA）和N甲基对硝基苯胺（上海阿拉丁化学有限公司）; 甲酸（美国SigmaAldrich公司）; 乙腈、甲醇（LCMS级，德国Merck公司）; 双蒸水（香港屈臣氏基团有限公司）; 其它试剂均为分析纯。

2.2 溶液配制

三羟甲基氨基甲烷聚乙二醇（PEG）6000缓冲溶液（pH 8.4）的配制： 分别称取Tris 6.06 g，NaCl 10.23 g，乙二胺四乙酸二钠 2.8 g，PEG 6000 1.0 g，加水溶解，以HCl调节至pH 8.4，加水定容至1000 mL。

肝素钠标准品（S）溶液： 称取肝素钠标准品适量，按相邻高浓度与低浓度的剂量比1∶0.5加入TrisPEG 6000缓冲溶液，分别配制0.04 IU/mL（S1）、0.02 IU/mL（S2）、0.01 IU/mL（S3）和0.005 IU/mL（S4）4个不同浓度的肝素钠标准品溶液。

肝素钠供试品（T）溶液： 肝素钠供试品预估效价为200 IU/mL，按与标准品溶液同样的剂量比1∶0.5加TrisPEG 6000缓冲液，分别配制成0.04 IU/mL（T1）、0.02 IU/mL（T2）、0.01 IU/mL（T3）和0.005 IU/mL（T4）4个不同浓度的肝素钠溶液。

酶溶液： 用TrisPEG 6000缓冲液配制酶溶液，抗凝血酶III、IIa因子、Xa因子的浓度分别为0.005、0.01和0.005 IU/mL。

底物溶液： 用水分别配制0.15 μmol/L的S2238和S2765溶液。

pNA储备液： 称取4.0 mg pNA标准品，用50%（V/V）乙腈溶液定容在100 mL棕色容量瓶中，于4℃保存，备用。

标准工作溶液： 准确移取适量pNA储备液，分别配制1、3、5、25、50、100、200、500和1000 μg/L的pNA溶液，各加入等体积的50 μg/L内标物（ISTD）N甲基4硝基苯胺，混匀备用。

pNA质控样品： 将上述pNA储备液用水稀释成相应浓度，配制质控样品，用于方法学验证。质控样品包括低浓度质控（5 μg/L）、 中浓度质控（50 μg/L）和高浓度质控（500 μg/L）样品。

2.3 液相色谱质谱方法

在线固相萃取与液相色谱质谱联用系统如图1所示。

在线固相萃取条件： ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（A， 12.5 mm×4.6 mm， 5 μm， 安捷伦公司），清洗流动相对应泵A流动相，组成为0.5%甲酸乙腈（9∶1， V/V），等度洗脱，流速为0.6 mL/min。

色谱分离条件： Poroshell 120 EC C18色谱柱（B，50 mm×2.1 mm， 2.7 μm，安捷伦公司）为分析柱，流动相为水乙腈（4∶6， V/V），等度洗脫1.8 min; 流速为0.4 mL/min; 进样量为2 μL; 柱温35℃。

电喷雾质谱（ESIMS）条件： 正离子模式; 碎裂电压： 90 V; 干燥气温度： 350℃; 雾化器压力： 2.76×104 Pa; 干燥气流速： 10 L/min; 毛细管电压： 4000 V; 采用多重离子监测模式（MRM）进行定量分析，pNA定量离子对： 母离子m/z 139.1，子离子m/z 122.0，碰撞能量（CE）为13 V; ISTD定量离子对： 母离子m/z 153.1，子离子m/z 136.0，碰撞能量（CE）12 V。

参照近年来在线样品前处理技术报道[26～28]，本研究在一套商品化的高效液相色谱质谱联用仪基础上，通过一个十通阀将另一个液相色谱泵与之相连，并配两根色谱柱（色谱柱A和色谱柱B），实现对效价反应体系样品的在线固相萃取和分析，包括以下3个步骤： （1）装载和清洗 六通阀（阀A）处于虚线连通位置，自动进样器将待分析样品注入阀A的定量环中; 然后阀A切换至实线位置，定量环中的样品随泵A流动相流入色谱柱A（在线SPE柱）中，其中效价反应体系中洗脱下来的蛋白和盐类等物质经阀A最后进入废液，而pNA和内标物（ISTD）被保留在在线SPE柱中，清洗时间为1.2 min; （2）洗脱和分离 1.2 min后，切换阀A和阀B至虚线连通位置，色谱柱A和色谱柱B（分析柱）串联连接，泵B流出的流动相水乙腈（4∶6，V/V）以流速0.4 mL/min等度洗脱1.8 min。在线SPE柱上保留的目标物pNA和内标物被洗脱到分析柱上并进行分离和质谱检测; （3）平衡 待样品分析完成后，阀A和阀B切换至实线位置， 系统平衡1 min，切换阀A重新至进样位置，则重新进样，依此循环至所有样品分析完成。

2.4 肝素生物效价的测定

2.4.1 抗IIa因子 将肝素钠、IIa因子溶液和底物（S2238）溶液提前孵育在37℃的水浴锅中。参考药典方法[16]，构建抗IIa因子效价反应体系。抗IIa因子效价反应体系由肝素钠、AT Ⅲ、FIIa以及底物S2238组成，在合适的条件下反应生成pNA。空白抗IIa因子效价反应体系指未加入底物S2238的上述化合物的混合物。取25 μL不同浓度的肝素标准品（S）和供试品（T），按照S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4的顺序分别加入到96孔板中，然后依次在每孔中加入25 μL的AT Ⅲ，混匀后放置2 min。随后每孔加入50 μL IIa因子，混匀后放置2 min，再加入50 μL S2238，混合振荡。5 min后， 加入150 μL乙腈淬灭反应，取出100 μL淬灭后的反应液与100 μL内标物混合，经0.22 μm滤膜过滤后直接进行LCMS分析，计算pNA浓度。

2.4.2 抗Xa因子 抗Xa因子效价反应体系由肝素钠、ATⅢ、Xa因子以及底物S2765组成，在合适的条件下反应生成pNA。空白抗Xa因子效价反应体系指仅未加入底物S2765的上述化合物的混合物。步骤同2.4.1节所述，使用底物S2765和Xa因子分别代替抗IIa因子效价反应体系中的底物S2238和酶IIa因子，建立抗Xa因子效价反应。

2.4.3 计算方法与结果评定 使用肝素钠标准品，按照生物检定统计法（中国药典2015年版第三部通则）[29]中的量反应平行线原理4×4法，以pNA浓度值为纵坐标，标准品系列溶液（或供试品系列溶液）浓度的对数值为横坐标， 分别做线性回归，计算效价及实验误差。可靠性检测结果： 回归应p<0.01， 偏离平行应p >0.05，二次曲线应p >0.05，反二次曲线应p >0.05，认为结果可靠。可信限率（FL，%）反映检定结果的精密度。对于供试品，要求按干燥品计算，1 mg抗IIa因子的效价不得低于180 IU，抗Xa因子效价与抗IIa因子的效价比应为0.9～1.1。

3 结果与讨论

3.1 在线前处理/液相色谱质谱联用方法的建立

在线固相萃取系統的操作条件对样品前处理的效果具有重要影响。为了保证在尽可能去除干扰的基础上，获得良好的分离度和峰形，首先对在线固相萃取系统的清洗流动相组成、洗脱时间及流速等条件进行优化。经过上样步骤后，基质和目标化合物会一起吸附在SPE柱上，需要在目标化合物被洗脱前用合适的清洗流动相除去部分的干扰物。在所选用的ZORBAX Eclipse Plus C18柱上，适当提高清洗流动相中有机相的比例可以改善去除杂质的效果，然而若有机相比例过高， 会使pNA从SPE柱上被过早洗脱下来，造成目标化合物的流失。结果表明，使用0.05%甲酸乙腈（9∶1， V/V）作为清洗流动相，流速为0.6 mL/min时，去除酶反应溶液中的蛋白和盐类等物质的效果较好，主要杂质可以在前1.2 min内基本除去，且可使pNA及内标物保留在SPE柱上。由此确定阀B切换使在线SPE柱与分析柱串联的时间点为1.2 min。

考察了不同比例的水乙腈体系作为洗脱流动相的效果。

结果表明，采用水乙腈（4∶6，V/V）可以有效地将pNA和内标物从在线SPE柱上洗脱下来，同时该流动相条件也可以使pNA和内标物在分析柱上进行有效的分离（图2）。目标化合物于在线SPE柱上的洗脱和分析柱上的分离串联进行，有效简化了分析步骤，减少了阀切换的次数，使得方法更为稳定可靠。

在优化的实验条件下，对Xa因子和IIa因子催化的酶反应溶液进行了分析，结果如图2所示。pNA和ISTD分别在1.93和2.14 min出峰，分离度和峰形良好。样品经在线SPE柱处理后，有效减少了复杂样品基质对质谱分析的影响。同时，采用 MRM 检测的扫描模式进一步降低了杂质的干扰。

3.2 方法学验证

3.2.1 标准曲线、线性范围及定量下限 取2.2节配制的标准工作溶液进行在线SPE/LCMS分析，以pNA和内标的峰面积之比（I/I0）为纵坐标，pNA浓度为横坐标，进行线性拟合和回归分析，其中线性回归权重系数为1/x2。结果表明，在3～1000 μg/L浓度范围内，I/I0与反应产物pNA浓度具有良好的线性关系，相关系数（r）为0.9995，线性方程为y=0.277x+0.003。根据10倍信噪比计算pNA的定量下限（LLOQ）为3 μg/L。

3.2.2 特异性 在优化的在线固相萃取、色谱分离和质谱检测条件下，分别分析抗IIa因子和抗Xa因子的空白效价反应体系，考察方法的特异性。从图3可见，空白抗IIa效价反应体系和空白抗Xa因子效价反应体系中未检出干扰pNA检测的信号。

3.2.3 准确度和精密度 分析方法的准确度用于描述测得值与分析物标示浓度的接近程度。精密度用于描述重复测定结果的接近程度。取低、中、高3种不同浓度的质控样品分别连续进样6次，进样时确保浓度从低至高，测定对应峰面积的相对标准偏差，用于表征方法的日内精密度。将3个浓度的样品，每天检测6次，连续检测3天，获得方法的日内精密度。方法的精密度和准确度结果见表 1。 pNA分析方法的日内与日间精密度分别为1.1%～5.4%和3.8%～10.9%， 准确度为88.8%～100.6%。方法的准

确度和精密度均符合药典要求。

3.2.4 基质效应 质谱作为定量分析检测手段时，离子化时基质中的一些物质会与目标化合物发生竞争，使得目标化合物的离子化效率增加或降低，从而导致其响应值的提高或降低。通过比较等浓度pNA在空白效价反应基质与缓冲液中的响应值评价基质效应。在由酶（IIa因子、Xa因子和AT Ⅲ）、缓冲盐溶液和肝素混合组成的空白效价反应溶液中按质控样品的低、中、高3个浓度水平加入pNA标准品，与其对应的质控样品比较（表1）。空白效价反应基质的基质效应在89.9%～96.9%之间，说明本方法中空白效价反应溶液对pNA定量及效价检定影响较小，在可接受的范围内。

3.2.5 稳定性 考察了经乙腈淬灭并等体积添加内标物后的效价反应溶液在不同条件下的稳定性，结果见表2。3个浓度水平的样品在室温放置12 h、Symbolm@@4℃下保存24 h以及48 h内进行3次冻融循环（Symbolm@@20℃和室温）后，测得pNA的浓度与新配制的相应浓度质控样品的比值在102.1%～109.1%之间，相对标准偏差在1.8%～12.3%之间，表明不同条件存储后pNA未明显变化，pNA在效价反应体系中具有良好的稳定性。

3.3 测定肝素钠供试品生物效价

肝素类药物结构复杂，其活性不能用单纯的重量单位描述，需要以药典对照品的活性为参照，获得标准化的活性单位，从而保证病人的用药剂量在使用不同来源药品时保持一致。2015年版《中国药典》三部收载1431生物鉴定统计法[29]，其中一种方法为量反应平行线法。量反应是指药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者。量反应平行线测定法要求在一定剂量范围内，生物检定标准品（S）和供试品（T）的对数剂量和反应或反应的特定函数呈直线关系，当S和T的活性组分基本相同時，两直线平行。按照上述方法对两个肝素钠供试品进行生物效价的测定，结果如图4所示，肝素钠供试品和肝素钠标准品的产物产生量和肝素浓度的对数值的曲线基本呈平行线。采用本方法，以肝素钠标准品（150509200912）作为对照，利用量反应平行线原理4×4法计算供试品效价，结果见表3。供试品1的抗IIa因子效价和抗Xa因子效价分别为196.06和196.05 IU/mL，供试品2的抗IIa因子效价和抗Xa因子效价分别为195.92和196.07 IU/mL。另外，对于实验数据用量反应平行线4×4法进行统计学分析，效价的可信限率（FL，%）均小于10%，且回归显著（p<0.01），偏离平行、二次曲线，反向二次曲线偏差均不显著（p>0.05），说明检定结果可靠。文献＼[30＼]报道肝素的抗Xa因子与抗IIa因子的效价比≈1。本方法测定的两个肝素钠供试品的抗Xa因子效价与抗IIa因子的效价比均为1.00，与文献＼[30＼]报道的结果一致。按照美国药典收载的肝素钠质量标准的相关要求，两个肝素钠供试品的抗Xa因子效价与抗IIa因子效价的比值在0.9～1.1范围内。肝素钠效价按干燥品计算1 mg活性需大于180 IU。本方法测定的两个肝素钠供试品的生物效价指标符合药典标准。综上，本研究开发的基于在线固相萃取/液相色谱质谱联用分析测得肝素钠生物效价的方法是准确可行的。

3.4 与药典方法[16]的比较

将本方法与2015版《中国药典》二部中肝素钠效价测定中抗IIa因子和抗Xa因子测定方法进行了对比。结果表明，本方法中酶和底物的用量减少，节省了检测成本; 在线固相萃取操作简单，可实现自动化，减少了人为操作带来的误差; 在线SPE色谱柱可以多次使用，降低了成本。

4 结 论

建立了在线固相萃取/液相色谱质谱（online SPE/LCMS）联用方法，用于肝素类药物生物效价的测定方法。本方法直接分析经稀释过滤的IIa因子和Xa因子的酶催化反应溶液，灵敏度高，样品无需进行前处理，操作简单快捷，灵敏度高，方法重现性好，并获得了较好的准确度和精密度。系统的方法学考察表明， 本方法可满足肝素钠生物效价测定的分析要求，为生产中肝素钠的质量评估提供了新方法。

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