蔡芳 任繁栋 任达兵 刘韶 易伦朝

摘 要：采用超高效液相色谱四极杆轨道阱质谱联用技术，使用Thermo scientific Hypersil GLOD色谱柱，以0.1%甲酸乙腈为流动相，应用梯度洗脱程序对肾间质纤维化大鼠血清中的大黄素及其代谢物进行了分析。将质量亏损、中性丢失、诊断碎片离子过滤等技术互相融合，提出了一种可高通量靶向鉴定药物有效成分在体内的代谢物的方法，并将本方法应用到大黄素大鼠血液代谢物的鉴定中，鉴定出大黄素在大鼠体内的11种代谢物及39种可能的代谢物，并证明大黄素在大鼠体内的Ι相代谢途径主要是氧化和羟基化，Ⅱ相代谢途径主要是硫酸酯化和葡萄糖醛酸化。本方法有效减少了定性分析过程中基质和干扰离子的影响，提高了代谢物定性分析的效率和准确性。

关键词：超高效液相色谱高分辨质谱联用技术; 质量亏损; 诊断碎片离子; 中性丢失; 大黄素

1 引 言

超高效液相色谱高分辨质谱联用技术（Ultra high performance liquid chromatographyhigh resolution mass spectrometry， UPLCHRMS）作为一种强大的分析工具，可为化合物的结构鉴定提供丰富的信息[1，2]。 然而，由于数据的高复杂度，也给高通量靶向鉴定目标代谢物带来困难。同时，目标代谢物分析过程中容易受到其它代谢物或基质的干扰，甚至在某些情况下，干扰离子的强度远高于真正的质谱特征，从而难以从原始数据中快速鉴定目标化合物，增加了代谢物的定性分析的难度。

目前，UPLCHRMS数据处理的策略主要有质量亏损过滤（Mass defect filtering， MDF）、氮规则过滤（Nitrogen rule filtering， NRF）、中性丢失过滤（Neutral loss filtering， NLF）和诊断碎片离子过滤（Diagnostic fragment ion filtering， DFIF）等。质量亏损是指在核形成和稳定时，不同的元素或其同位素需要吸收或释放不同的能量，进而导致能量发生变化。简言之，即是一种元素或者化合物的精确质量与其最接近整数值之间的差值[3]。质量亏损过滤可以有效地净化色谱图，排除期望质量范围外的化合物，降低质谱解析的复杂度[4]。然而，仅采用质量亏损过滤很难全面地过滤干扰离子。诊断碎片离子过滤的方法是基于具有相同或相似骨架的化合物在相同的碰撞电压下会有相似的质谱裂解，产生相似的碎片信息而提出的。这种方法有助于物质裂解规律的推测[5]。物质在裂解过程中，会失去一些不带电荷的基团，例如CH3、SO3、H2O等。这些中性丢失信息有助于推测物质发生的反应类型、取代基的种类及其质谱裂解规律，可快速、有效地为物质发生的代谢反应提供合理的证据，但是，不能推测化合物的主体结构信息[6]。质量亏损过滤可有效地净化谱图，筛选已知与未知化合物信息; 中性丢失过滤有助于了解化合物的裂解规律及官能团特征; 诊断碎片离子过滤可以筛选具有相同骨架的化合物。单一过滤策略常难以避免定性分析过程中的假阳性和假阴性。整合多种过滤方法可在高通量定性分析多种化合物的同时，提高定性效率和准确性，有望成为高通量靶向定性分析的有效方法。

大黄是蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄及药用大黄的干燥根或干燥茎[7]。大黄中含有蒽醌类、蒽酮类、二苯乙烯类、鞣质类、有机酸等化合物。大黄素是大黄中的重要活性成分，也是药效物质基础标志物之一[8，9]。本研究仅以大黄提取液中的大黄素为研究对象，采用整合定性分析策略对其在血液中的Ⅰ相代谢物和II相代谢物进行高通量靶向筛选和定性分析，并以此为例说明整合定性分析策略高通量靶向筛选、定性分析代谢物的过程和有效性。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

UltiMate 3000超高效液相色谱仪、Q Exactive台式四极杆轨道阱高分辨质谱（美国Thermo Scientific公司）; MXF微型涡旋混合器（上海伟进生物科技有限公司）; MilliQ A10超纯水机（德国Merck公司）。

乙腈、甲醇（质谱纯，德国Merck公司）; 甲酸（色谱纯，SigmaAldrich公司）; 大黄素（Lot code： 151008）、大黄酸（Lot code： 150528），纯度>98%（上海源叶生物科技有限公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 大黄单煎液的制备 取18 g大黄药材，加入10倍量的蒸馏水加热回流1.5 h，倾出提取液后，药渣用8倍量的水再加热回流提取1 h，合并两次煎液，浓缩至100 mL。

2.2.2 动物实验 SPF级SD雄性大鼠40只（6～8周龄，体重： 180～220 g），生长状态良好，购自长沙斯莱克实验动物有限公司。大鼠饲养于温度为（22±2）℃， 相对湿度55%±2%，清洁无菌的环境中，每天给予12 h光照。所有大鼠自由采食、自由饮水。大鼠适应性喂养一周后，对其进行称重、编号，并根据体重采用随机区组设计对大鼠进行分组，共3组： 假手术组（16只），UUO模型对照组（14只），大黄提取物干预组（10只）。所有大鼠饲养于中南大学动物部大鼠房。实验均严格按照中南大学动物管理委员会的管理条例使用和处理动物。大鼠在手术前一天下午禁食。

UUO大鼠模型制备： 手术前称量并记录每只大鼠的体重，根据体重计算（按0.35 mL/100 g计算）所需麻药（10%水合氯醛溶液）剂量，进行腹腔麻醉。将大鼠脊柱及左侧约4 cm×6 cm大小的区域剃毛备皮，络合碘消毒; 在肋脊角下、脊柱左侧做长约1.5 cm的纵行切口，分离肌肉，并剪开腹膜，暴露出左侧肾脏，剥离肾蒂周围脂肪与筋膜，分离输尿管，于紧靠肾盂处及离肾盂约1.5 cm处结扎输尿管，并从中间剪断; 逐层缝合组织与皮肤。

给药： 自手术当天大鼠麻醉苏醒后，连续14天灌胃。干预组给予大黄单煎液灌胃，灌胃体积： 1 mL/100 g。 模型组灌胃生理鹽水。每日定时灌胃给药，并观察大鼠情况。

采血： 大鼠处死前24 h禁食，腹腔麻醉后心脏采血，血清样本置于80℃保存。

2.2.3 大黄代谢物的检测 （1）血清样品的制备 样品解冻后，取大黄提取物干预组大鼠血清样本300 μL于离心管中，加入1200 μL乙腈去蛋白，涡旋1 min后，在4℃下14500 r/min离心10 min。取上清液，常温下氮气吹干，再加入150 μL甲醇复溶，涡旋1 min后，在4℃下14500 r/min，离心10 min。取上清液置于进样瓶中待进样。（2）液相分离条件 色谱柱为Thermo scientific Hypersil GLOD （100 mm×2.1 mm ID，1.9 μm）分析柱。流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸，梯度洗脱： 0～4.0 min，5%～15% B; 4.0～8.0 min，15%～25% B; 8.0～14.0 min，25%～30% B; 14.0～16.0 min，30%～33% B; 16.0～22.0 min，33%～45% B; 22.0～23.0 min，45%～55% B; 23.0～25.0 min，55%～60% B; 25.0～28.0 min，60%～90% B; 28.0～29.0 min，90%～5% B; 29.0～30.0 min，5% B。柱温： 35℃，流速： 0.2 mL/min，进样量2 μL。（3）质谱条件 HESI离子源离子化模式： 负离子模式; 扫描模式： full MS （resolution 35000） 和 MS/MS （resolution 17500）; 扫描范围： m/z 100～1000; 喷雾电压： ×3.2 kV; 毛细管温度： 320℃; 鞘气压力： 3 MPa; 辅助气压力： 0.8 MPa; 探针（Probe）温度： 350℃; SLens RF level： 50; 碰撞能量： 25、35和50 eV。

2.3 数据处理过程

首先，采用MZ mine2.32软件对UPLCHRMS数据进行色谱峰的构建、解卷积及分子式的预测等处理[10，11]。然后，通过数据转换软件MS convert将其转换为.mzXML格式的数据，并运用RStudio1.0.44运行自编的R语言脚本文件对提取到的数据进行质量亏损过滤、中性丢失、诊断碎片离子过滤，以缩小代谢物的鉴定范围[12]。最后通过数据库（HMDB、Scifinder、Chemspider、MassBank）匹配、查阅参考文献，实现大黄素代谢物的定性分析。其数据处理的流程如图1所示。

3 结果与讨论

3.1 质量亏损过滤分析

药物在体内经过Ι相和Ⅱ相生物转化后，其性质会发生变化，但药物的核心结构不会发生彻底的改变。因此，药物代谢物的质量亏损与药物原型成分的质量亏损值相似[13，14]。大黄素在体内可能发生的Ι相和Ⅱ相反应的质量数变化及其质量亏损值如电子版文后支持信息表S1所示。根据文献报道，大黄素在大鼠体内的代谢途径主要包括氧化、羟基化、硫酸酯化和葡萄糖醛酸化[15，16]。本研究以大黄素的母体结构为Ι相反应的模板分子，大黄素发生硫酸酯化、葡萄糖醛酸化后的产物为Ⅱ相反应的主要模板分子，并基于大黄素在体内可能发生的代谢途径及其代谢后物质的质量变化，设定了3个不同的质量亏损窗口。质量亏损窗口的设定是影响质量亏损过滤效果的关键因素，窗口设定范围过大会导致非目标代谢物的干扰，而窗口设定范围太小又将会使目标代谢物被过滤掉。本研究中质量亏损范围主要依据大黄素在体内可能发生的Ι相代谢反应出现的最大分子量的变化确定。Ι相反应质量变化最大的是3次羟基化（见电子版文后支持信息表S1），质量变动47.9847 Da，因此，将3个模板分子的质量范围设定为模板整数值加减48 Da。其质量亏损窗口的设定结果如表1所示。根据设定的质量亏损窗口，从UPLCHRMS获得的13115个质谱碎片中筛选出344种可能与大黄素代谢有关的代谢物，有效地去除了背景离子的干扰，缩小了定性分析的范围。

3.2 中性丢失过滤分析

化合物在裂解过程中会失去一些不带电荷的基团，如CH3、CO、CO2、H2O、CHO和O等，即中性丢失。基于大黄素的结构特点，并查阅相关文献[15，17～19]，分析大黄素在体内的代谢途径（如电子版文后支持信息图S1所示），运用R studio软件运行自编的R脚本文件对数据进行中性丢失过滤，其过滤结果如表2所示。

单一的中性丢失过滤得到的质谱干扰信息仍然较多，且不能准确地定性分析出目标化合物。因此，在质量亏损过滤的基础上，选择出现频率较高且具有代表性的中性丢失进行过滤，其过滤结果如图2所示。结合质量亏损过滤和中性丢失过滤有效地缩小了质谱定性分析的范围，减少了定性分析过程中非靶向代谢物的干扰，同时也有助于下一步代谢物裂解规律的总结和代谢物结构的推断。通过中性丢失过滤与质量亏损过滤策略的有效结合，本研究從55个质谱碎片中筛选出36种可能的代谢物。

3.3 診断碎片离子过滤及物质的定性分析分析

为了排除质量亏损过滤与中性丢失过滤过程中的假阳性结果，运用诊断碎片离子过滤对原始数据进行筛选，结合质量亏损过滤与中性丢失过滤的结果对36种可能的代谢物进行进一步的筛选。诊断碎片离子的确定主要基于大黄素在体内转化生成其它游离型的蒽醌类物质（大黄酚、大黄酸及芦荟大黄素），及其在代谢过程中母体结构不会发生改变，且裂解规律相似的原理[15，20，21]。本研究对大黄素代谢物的裂解情况和规律进行了总结和归纳，确定了大黄素代谢物的诊断碎片离子，其诊断碎片离子的结构及其相互转化后的代谢物的裂解规律，如电子版文后支持信息图S2所示。

进一步筛选诊断碎片离子，定性分析出了11种代谢物，主要是大黄素经Ι相反应（主要是氧化、羟基化、去甲基化）和Ⅱ相反应（主要是葡萄糖醛酸化和硫酸酯化）的产物，或者是经Ι相反应再经Ⅱ相反应的产物，这与文献＼[15，22＼]报道大黄素的Ⅱ相反应主要是葡萄糖醛酸化和硫酸酯化一致，其定性分析结果如表3所示，其可能的结构如电子版文后支持信息图S3所示。诊断碎片离子过滤有效排除了定性分析过程中的假阳性。造成这些代谢物的假阳性主要是由于同一类化合物的裂解具有相似的规律，而一些分子质量大的代谢物会产生与小分子质量代谢物相同的碎片信息，因此将一些分子质量大的代谢物的碎片定性分析为一种代谢物。

基于文献报道的信息、大黄素可能发生的Ι相反应及其分子式改变的情况（如电子版文后支持信息表S1所示），预测其代谢物可能的分子式，通过准确质荷比信息，提取不同质荷比的一级质谱图，并判断其峰形，然后对比文献报道的信息，对没有二级质谱的物质进行定性分析。最后从一级质谱中初步定性分析出39种代谢物，其定性分析结果如表4所示，其可能的结构如图3所示。

4 结 论

整合定性分析策略有效减少了质谱定性分析过程中干扰离子的影响，提高了准确定性分析的覆盖率，减少了定性分析过程中的假阳性。但是，由于一些代谢物的质谱信息缺失，如没有二级质谱，无法对其进行准确定性分析。为了实现更多代谢物的准确定性分析，应对UPLCHRMS的数据采集方式、质谱参数等进行优化，使更多的代谢物离子化，扩大检测的范围，使代谢物产生丰富的二级质谱。 同时，为了更有效地运用本方法进行靶向代谢物的定性分析，应充分了解代谢物的类型、结构特点及其在体内或者体外的转化途径，合理有效地运用不同的质谱过滤器，实现代谢物的准确定性分析。

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