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犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析

2019-09-19 02:27:29 《湖北畜牧兽医》 2019年8期

师丽敏 夏冬华 程台格

摘要:使用Vero细胞接种临床症状疑似感染犬流感病毒(CIV)的犬肺组织,盲传3代,观察其病变情况,收集72 h培养液进行PCR鉴定、血凝特性及形态学观察,同时进行序列测定和分析,并制作系统进化树。结果表明,从犬肺中成功分离出一株犬流感病毒,该病毒能够凝聚豚鼠、猪、鸡抗凝血,电镜观察病毒呈圆形、长丝状等形态多样、大小不等的颗粒状;序列分析表明,与人源、犬源等10株有代表性的流感病毒基因同源性极高,只有少数地方發生了特异变异。这些数据的分析对于犬流感的防控有一定的参考价值。

关键词:犬流感病毒;分离鉴定;基因序列

中图分类号:S858.292        文献标识码:A        文章编号:1007-273X(2019)08-0009-02

犬流感是由犬流感病毒(CIV)引起的犬的一种接触性传染病,该病的主要临床症状表现为发热、流涕和咳嗽。CIV是犬传染性呼吸系统疾病的主要病原之一,其容易引起犬的支气管炎和支气管肺炎,损害呼吸道上皮细胞,给其他病原体的感染创造了条件。该病对于世界各国养犬业的发展也产生了一定的影响。

CIV在分类上属于副黏病毒科副黏病毒亚科如布拉病毒属。其与同属的猴病毒V型、人SV5分离株及人流感病毒等抗原性密切相关。当前,市场上虽然有相关疫苗,但是该病的发生率依然很高,之所以出现这种现象可能与该病毒的不断变异存在一定的关系。基于该原因,分离当前的流行变异株、了解序列变异情况对于该病的预防、诊断及治疗意义重大。本试验对一例疑似犬流感病例的肺组织中分离出的病毒进行了鉴定,并尝试对该病毒中的部分基因序列进行了分析,探讨了其出现遗传变异的情况。现将其报道如下。

1  材料与方法

1.1  材料

本研究选取临床诊断为犬流感的病死京巴犬1只,其年龄约1岁左右,临床表现为患犬精神萎靡不振、不喜进食、咳嗽、流涕、喘息等呼吸道症状,同时还伴有发热等不良症状。最终该犬治疗无效死亡,将病犬的肺脏取出进行处理[1]。

细胞系:Vero细胞购于海南壹田生物科技有限公司,并用于后期的分离鉴定和部分基因序列分析。

1.2  病毒分离

参照已有的分离方法对病毒进行分离,并将成功分离的病毒命名为QF20180726。

1.3  病毒鉴定

血凝试验:分别采集豚鼠、鸡、猪抗凝血,使用PBS液洗涤红细胞四次,1 500 r/min离心10 min,用PBS液配成1%红细胞悬液进行血凝试验。然后对细胞培养液负染色,进行电镜观察[1]。

2  结果与分析

2.1  病毒分离培养

病料接种到Vero细胞第五代24 h后出现典型细胞病变,截止到第5天收毒的时候,大部分细胞融合、裂解死亡,培养液中碎片增多,相同条件下的正常细胞没有出现这种变化。

2.2  血凝试验

病毒在25 ℃的环境下能够凝集豚鼠、猪、鸡红细胞。

2.3  RT-PCR鉴定结果

对Vero细胞培养病毒进行犬流感病毒的RT-PCR检测,最终结果显示,Vero细胞培养的病毒为CIV阳性。

2.4  电镜观察

电镜片显示,CIV为圆形,有囊膜,其直径为80 mm左右,囊膜上有直径8~10 nm的纤突。病毒因囊膜破损而呈现出不规则的形态,成多形性、长丝状等。

2.5  N基因序列同源性分析

与人源、犬源等10株有代表性的流感病毒N基因相比较,核苷酸同源性为95.7%~99.8%,氨基酸同源性为97.4%~99.6%。有两处氨基酸发生了新的变异,分别是第257位由V变成了A,第301位由A变成了T。其中与人源流感病毒分离株LN同源性最低,为97.4%,与犬源流感病毒分离株08-1990和D277同源性最高,均为99.6%。

2.6  F基因序列同源性分析

与人源、犬源等10株有代表性的流感病毒F基因相比较。核苷酸同源性为94.7%~99.6%,氨基酸同源性为95.6%~99.3%。有两处发生特异变异,其分别是第56位由T转变为S,第89位由T转变为M。其中与人源流感病毒分离株LN同源性最低,为95.6%,与犬源流感病毒分离株08-1990同源性最高,为99.3%。

2.7  HN基因序列同源性分析

与人源、犬源等10株具有代表性的流感病毒HN基因相比较,核苷酸同源性为95.5%~99.8%,氨基酸同源性为96.3%~99.6%,其中与人流感病毒分离株LN同源性最低,为96.3%,与犬源流感病毒分离株D277同源性最高,为99.6%。

2.8  N、HN和F基因克隆、测序

使用设计的N、F和HN基因引物扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳,分别可以见到约1 680、1 970和1 830 bp左右的3个基因片段,其大小与N、F和HN蛋白基因类似,预测结果证实本试验所克隆的基因是正确的,这也从侧面说明本次研究是有效的。

3  小结与讨论

本研究在对该病进行分析时,已经建立起了病毒分离、血凝、血凝抑制监测方法以及RT-PCR方法,但是这些方法对实验条件的要求相对比较高,而且所需要的时间也比较长,其推广难度相对来说比较大。而分离鉴定及部分基因序列分析则是一种简单、快速、准确的基因测试法。本研究对CIV检测的反应条件进行了优化,提高了犬流感病毒分离鉴定及部分基因序列分析的特异性和灵敏度,该技术基本上克服了当前临床和实验室诊断CIV方面存在的不足,其操作条件简单方便,在对病毒进行分析和测试时,不需要太过复杂的仪器设备、分离成本比较低,为相关疾病的诊断和治疗提供了较大的便利。

犬流感是一种可以在成年犬间快速传播、引起犬呼吸系统不畅的疾病,该病在比较严重的情况下会造成犬只死亡。据相关研究表明之所以会出现犬流感病毒,是因为这些流感病毒来源于异种动物。流感病毒与其他病毒不同,其可以突破种间屏障,感染异种动物,犬作为宠物与人接触密切,因此对该病必须要引起足够的重视。本试验之所以开展分离鉴定及部分基因序列分析,就是为了建立一种行之有效的CIV检测方法,其对于开展CIV的综合防治与疾病诊断有着极为重要的意义。

据血清学调查表明,CIV在世界各地普遍存在,是危害犬业发展的主要传染病之一,该病毒在所有的犬类中都有流行,对于已经患病的犬来说,还可能会引发其他的并发症,如急性脑脊髓炎、脑内积水等,该病的出现严重危害了犬类的健康生长。近些年来,随着我国养犬业的不断扩大,CIV也受到了越来越多人的重视[2]。

本试验以海口某动物医院诊治的1例临床诊断疑似CIV感染京巴犬作为对象,发现其在患病之后的主要临床症状表现为精神萎靡不振、不喜进食、咳嗽、流鼻涕、喘息声粗重等呼吸道症状,同时还伴有发热等不良症状,因治疗无效而死亡。一般情况下,犬单独感染CIV的情况并不多见,在对死亡病犬解剖检查时,发现病犬的死亡可能与细菌、支原体和病毒等混合感染有一定的关系。为了更加深入分析CIV变异情况,本试验从患犬肺组织中分离得到了一株CIV,并结合实验室检测手段对其中的部分基因序列进行了分析,详细研究了基因变异情况。结果表明该病毒能够在4 ℃条件下将豚鼠、猪、鸡等凝聚到一起,这一特性与CIV的血凝特性基本上是一致的。在电镜下观察病毒株结构时,发现其超微结构呈圆形、长丝状等不规则形态。

通过对N、HN和F基因进行扩增和测序,其核苷酸和氨基酸同源性分析和系统进化关系显示,与10株有代表性的犬流感病毒N基因核苷酸的同源性为95.7%~99.8%,氨基酸同源性為97.4%~99.6%,其中有两处氨基酸发生了全新的变异:第257位由V变成了A,第301位由A变成了T;其中与人源流感病毒分离株LN同源性最低,为97.4%,与犬源流感病毒分离株08-1990和D277同源性最高,均为99.6%。HN基因分析显示,与10株有代表性的流感病毒HN基因核苷酸同源性为95.5%~99.8%,氨基酸同源性为96.3%~99.6%;其中与人源流感病毒分离株LN同源性最低,为96.3%,与犬源流感病毒分离株D277同源性最高,为99.6%。与10株有代表性的流感病毒F基因核苷酸同源性为94.7%~99.6%,氨基酸同源性为95.6%~99.3%[3]。有两处发生特异变异,分别是56位由T变成S,89位由T变成了M。其中与人源流感病毒分离株LN同源性最低,为95.6%,与犬源流感病毒分离株08-1990同源性最高,为99.3%。F基因的遗传变异对于CIV的预防有着极为重要的影响,特别是重要抗原位点的变化,其可能会导致疫苗的免疫保护不够全面,本次分离株F基因的变异是否能导致疫苗的免疫保护不全或者是增加CIV的毒力变化值则还需要进一步深入研究和分析。N、HN和F基因序列分析还表明,犬流感病毒流行毒株之间氨基酸序列变化并不是很大,但与其他毒株之间的差异相对来说是比较大的。

4  结论

本试验成功分离出一株犬流感病毒,该病毒在25 ℃条件下可以成功吸附豚鼠、鸡、猪血红细胞。电镜观察显示病毒为圆形、长丝状等形态多样、大小不等的病毒粒子。结合N、HN和F基因序列分析显示,成功分离的犬流感病毒株与犬流感病毒分离株08-1990的亲缘关系是最近的,同时由于病毒感染,其基因序列发生了特异性变异。

参考文献:

[1] 罗思思,谢芝勋,谢丽基,等.H7亚型和N9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立[J].畜牧兽医学报,2015(7):1176-1183.

[2] 陈  樱,莫彦宁,周华波,等.类人H3N2犬流感病毒广西分离株的鉴定及其遗传演化分析[J].中国预防兽医学报,2015(5):401-404.

[3] 于志君,朱晓文,刘  红,等.A型流感病毒跨种传播和致病性相关蛋白研究进展[J].动物医学进展,2011(11):90-94.