陈 龙，吴兴利，闫晓刚，谷 巍，徐海燕，钱爱东，王春凤，张芳毓*

（1.吉林省农业科学院畜牧科学分院，吉林公主岭 136100；2. 山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安 271000；3. 吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118）

纤维素水解一直是人们关注的焦点和研究的热点[1]。通常，内切葡聚糖酶（CMCase，EC 3.2.1.4）主要参与纤维素分解的初始阶段，与外切葡聚糖酶（EC 3.2.1.91）和β- 葡糖苷酶（EC 3.2.1.21）以协同作用的方式诱导纤维素完全水解生成葡萄糖[2-3]。目前，内切葡聚糖酶被成功应用于洗涤剂[4-6]、动物饲料[7-9]、纸浆和造纸工业中[10]。芽孢杆菌具有较高的生长速率和较短的发酵周期，且是生产纤维素酶的重要种属之一[11-14]。据报道，芽孢杆菌的纤维素酶属于糖基水解酶5（GH5）家族[15]，研究人员已尝试在异源宿主大肠杆菌中进行克隆并表达纤维素酶基因[10]。虽然大肠杆菌因易于遗传操作，是重组蛋白生产的理想宿主，但在大肠杆菌中进行纤维素酶基因的表达存在2 个亟待解决的问题：第一，将重组蛋白质分泌到细胞外培养基中一直是阻碍其直接工业化应用的难题[10]；第二，在工业化生产过程中，高温导致内切葡聚糖酶活性降低[16]，内切葡聚糖酶活性受纤维素酶自身特性和高温等环境压力的影响[17-18]。因此，对具有高活性和热稳定性的重组内切葡聚糖酶的研究仍在继续[19]。

在前期研究中，本实验室从杜仲树皮内分离到一株B. velezensis 157，具有较高的内切葡聚糖酶活力[20-21]。本研究对编码B. velezensis 157 的内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌进行克隆和表达，并对重组酶进行表征。

1 材料与方法

1.1 菌株和载体 B. velezensis 157 由本实验室分离并保存，Peasy-Blunt Cloning Kit 克隆载体购自TaKaRa公司，Trans1-T1 宿主菌购自北京全式金公司，pET-32a表达载体，BL21（DE3）宿主菌由本实验室保存。

1.2 目的基因的克隆与序列分析 取适量纯化培养后B. velezensis 157 菌液，根据AXYGEN 细菌基因组DNA提取试剂盒（购自AXYGEN 公司）的说明书进行操作。根据NCBI 上已登录的芽孢杆菌属内切纤维素酶基因序列（登录号：KY797654），应用Primer Premier 7.0 软件设计1 对特异性引物：C1： CCATGAAAC GGTCAATTTCTATTTTTA；C2：CGCTAATT GGGT TCT GTACCCCAAATC。其中下划线部分分别为Bam HI 和Hind III 限制性内切酶切位点。PCR 反应体系为25 μL：0.5 μL 引物C1（浓度为0.25 μmol/L）、0.5 μL 引物C2（浓度为0.25 μmol/L）、2 μL dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸，浓度为1.25 mmol/L）、2.5 μL10×PCR 缓 冲 液（10mmol/L）、0.25 μL Ex Taq 酶（2.5 U/μL）、1 μL B. velezensis 157 基因组DNA、补充双蒸水至25 μL。DNA marker、Ex Taq 聚合酶、Bam HI 和Hind III 限制性内切酶、T4 连接酶均购自TaKaRa 公司。

预变性、变性、退火、延伸的反应参数分别为94℃5 min、30 个循环（94℃ 1 min、52℃ 1 min、72℃ 1 min）、72℃ 10 min。取2 μL PCR 产物经凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒（购自AXYGEN 公司）对产物进行纯化回收，PCR 产物交由库美公司进行测序。测序结果利用BLAST 序列同源性分析，ORF Finder 软件进行开放阅读框分析，利用NCBI 中BLASTX 程序与已知芽孢杆菌属内切纤维素酶基因进行比对，利用MEGA7.0 软件构建内切葡聚糖酶基因的系统发育树。内切葡聚糖酶氨基酸序列通过EXPASY、Signal P 3.0 Server、Pfam、CLC sequence Viewer 7.5、Illustrator for biological sequences 等软件进行分析[23]。

1.3 pEASY-157-CMCase 克隆质粒的构建 将CMCase基因的DNA 回收产物与Peasy 载体连接，连接产物进行Trans1-T1 转化等均按照p EASY-Blunt Cloning Kit使用说明操作。将内切葡聚糖酶基因的克隆质粒称为pEASY-157-CMCase，提取质粒（质粒小提试剂盒购自TIANGEN 公司）经PCR 验证后，送至库美公司测序鉴定。连接反应体系包括4 μL PCR 产物和1 μL pEASYBlunt 克隆载体。

1.4 pET32a-157-CMCase 表达质粒的构建 取实验室冻干保存的含pET32a 质粒的宿主菌DH5α 进行复苏，用液体LB 摇菌培养后提取质粒，-20℃保存备用。分别利用Bam HI 和Hind III 限制性内切酶，对测序正确的pEASY-157-CMCase 克隆质粒与pET32a 质粒进行双酶 切，37 ℃水 浴4 h。50 μL 体 系：43 μL pEASY-157-CMCase 质粒、5 μL 10×Buffer（1×K）、1 μL Hind III、1 μL Bam H I。分别回收内切纤维素酶片段和pET-32a空载体，用T4 连接酶将目的片段与空载体连接，16℃金属浴中过夜连接，10 μL 体系：6 μL157-CMCase 目的基因、1 μL10×连接酶缓冲液、1 μL T4 连接酶和2 μL pET32a 载体。将过夜连接的重组pET32a-157-CMCase表达质粒先进行DH5α 感受态转化，利用氨苄青霉素抗性筛选单菌落并进行提质粒、PCR 以及双酶切验证，并送至库美公司测序。将测序正确的重组质粒，转化至表达宿主菌BL21（DE3）并验证，并命名pET32a-157-CMCase BL21（DE3）。

1.5 ET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌的表达

1.5.1 重组pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌的诱导表达与可溶性分析 将构建好的pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌，以1%转接入100 mL 的液体LB（含Amp）培养至对数期。加入0.4 mmol/L IPTG 诱导8 h 后，于4℃ 12 000 r/min 离心20 min，洗菌3 次，进行超声破碎10 min（工作时间3 s，间隔时间3 s，总定时次数200），取超声破碎产物经12 000 r/min，4℃离心20 min 后，将沉淀和上清分别与等量的2×蛋白上样缓冲液混合，经沸水煮沸10 min 后进行SDSPAGE 检测，广谱蛋白Marker 购自北京全式金公司。

1.5.2 重组pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌的诱导表达优化、产酶部位确定及纤维素酶平板检测 间优化：将重组pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌以1%含量接入多瓶液体LB（含Amp）培养至对数期，设置非诱导对照组，其余试验组加入0.4 mmol/L IPTG后于37℃ 分别诱导2、4、6、8、10 h，取适量诱导后的菌液超声破碎处理后进行SDS-PAGE 检测。IPTG 浓度的优化：将IPTG 的浓度设定为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 的IPTG，诱导10 h 后，菌液经超声破碎处理后进行SDS-PAGE 检测。

取经优化诱导的重组pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌菌液15 mL，12 000 r/min，4℃离心20 min，上清液用0.22 μm 的微孔滤膜过滤，收集上清液作为上清组；加入PBS 缓冲液加到原体积重悬菌体进行超声破碎处理，工作时间3 s，间隔时间3 s，总定时次数200，破碎后于12 000 r/min，4℃离心20 min，上清液即为破碎菌体粗酶液；将诱导后的原菌液直接进行超声破碎处理即为上清液+菌体组。利用DNS 测定这3 部分的内切纤维素酶活力，确定纤维素酶产生部位[10]。最后通过刚果红染色法检验纤维素酶水解圈。上述试验均平行操作3 次，以平均值±标准误表示。

1.6 内切纤维素的酶活性测定 参考文献[21]配置葡萄糖标准溶液，测定其OD540nm值，绘制葡萄糖标准溶液的标准曲线。上清粗酶液的制备参考方法1.5.2。采用DNS 法检测内切纤维素酶活力以及DNS 的配置参考文献[24]：以0.05 mol/L，pH 为 5.0 的柠檬酸缓冲液作为溶剂，配置含1% 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）的底物溶液。取100 μL 底物与50 μL 粗酶液充分混合，于50℃恒温条件下水浴30 min，之后加入200 μL DNS 溶液终止反应，在沸水中煮沸5 min，冰水中冷却，加入1 mL蒸馏水混匀，取其中300 μL 加入酶标板，用酶标仪测定540 nm 下吸光值。每分钟底物被酶解产生1 μmol葡萄糖所需酶量定义为一个酶活力单位（IU）。

1.7 重组纤维素酶菌株的酶学性质分析

1.7.1 内切葡聚糖酶酶促反应的最适温度与热稳定性 在pH 为 5.0 的条件下，将粗酶液与柠檬酸缓冲液混合后，分别以30～90℃为反应温度作用30 min，分别测定相应内切葡聚糖酶酶活，最高酶活值记为100%，计算出各个温度下的相对酶活，确定出最适反应温度。在pH 5.0 的条件下，将粗酶液分别于40～90℃不同温度条件下保持30 min 和60 min 后，待粗酶液温度恢复至室温，以标准条件（pH 为5.0，60℃作用30 min）下测定残余内切葡聚糖酶酶活，同时以标准条件下粗酶液的内切葡聚糖酶酶活为100%，计算得出相对酶活，以此确定内切葡聚糖酶酶活的热稳定性。

1.7.2 内切葡聚糖酶酶促反应的最适p H 与p H 稳定性 在60℃的条件下，将粗酶液分别与pH 为4、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 的缓冲剂的底物（1% CMC-Na）混合，作用30 min，然后测定在这些pH 条件下的内切葡聚糖酶酶活，以酶活最高值记为100%，计算出各个pH 下的相对酶活，确定出最适反应pH。将粗酶液分别于p H 为4、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 的缓冲剂中60℃保持30 min 和60 min 后，以标准条件（pH 为5.0，60℃作用30 min）下测定残余内切葡聚糖酶酶活，同时以标准条件下粗酶液的内切葡聚糖酶酶活为100%，计算得出相对酶活，确定内切葡聚糖酶的p H 稳定性。

1.7.3 各种金属离子和化合物对内切葡聚糖酶的影响 配置10 mmol/L 的 金 属 离 子（BaCl2、CaCl2、NaCl、HgCl2、FeCl2、MgCl2、MnCl2、CoCl2、ZnCl2、CuCl2、KCl）；酶抑制剂（10 mmol/L EDTA、10 mmol/L 尿素、10 mmol/L β-疏基乙醇、1 mmol/L DMSO、1 mmol/L DEPC、1 mmol/L PMSF、10 mmol/L DTT），1%（v/v）的表面活性剂（Triton-X-100、Tween-20、Tween-80、SDS），缓冲剂是0.05 mol/L p H 5.0 的柠檬酸缓冲液。测定粗酶液分别与上述溶液混合保持60 min 后的酶活。以标准条件下粗酶液的内切葡聚糖酶酶活为100%，计算得出相对酶活，以此确定各种金属离子和化合物对内切葡聚糖酶酶活的影响。

1.7. 4 内切葡聚糖酶底物专一性的测定 分别以用0.05 mol/L，pH 5.0 的柠檬酸缓冲剂配置的1%CMC-Na、水杨苷、木聚糖、Whatman 滤纸、纤维二糖、微晶纤维素作为底物，测定内切葡聚糖酶对不同底物的酶活，确定内切葡聚糖酶的底物专一性。

1.8 统计分析 数据处理采用Graph Prism 7.0 软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）并绘制折线图和柱状图，数据用平均值±标准误表示。

2 结 果

2.1 B. velezensis 157 内切葡聚糖酶基因的原核表达

2.1.1 B. velezensis 157 内切葡聚糖酶基因的克隆与序列分析 以提取的B. velezensis 157 基因组为模板，经PCR、琼脂糖凝胶电泳和测序分析，获得与预期片段大小相符的1 500 bp（图1）。

图1 B. velezensis 157 内切葡聚糖酶的PCR 扩增

2.1.2 B. velezensis 157 内切葡聚糖酶基因的进化树分析 将 B. velezensis 157 内切葡聚糖酶基因经Blast 检测比对，应用MEGA 7.0 软件构建NJ 系统发育树。如图2 可见，B. velezensis 157 的内切葡聚糖酶蛋白自成一支；与B. velezensis SCGB 574 （CP023431.1）、B. velezensis JS25R （CP009679.1）、B. velezensis NAU-B3（HG514499.1）的内切纤维素酶基因相似度较高。

图2 B. velezensis 157 内切葡聚糖酶基因的进化树分析

2.1.3 重组内切葡聚糖酶基因的蛋白序列分析及结构预测 纤维素酶蛋白一级结构在线预测结果表明由499 个氨基酸组成，分子式为C2447H3788N678O754S8，预测分子量为55.02 ku，理论等电点（pI）为8.71，带负电荷的残基总数为52，带正电荷的残基总数为57。纤维素酶基因最大开放阅读框ORF 分析基因大小为1 500 bp，已ATG 为起始密码子，TAG 为终止密码子。应用PSIPRED 3.3 蛋白质二级结构预测，coil 无规则卷曲共计226 个氨基酸占45.29%，a- 螺旋共142 个氨基酸占28.45%，β-折叠共131 个氨基酸占26.25%。蛋白质三级结构分析，应用Swiss-Model Workspace 同源建模，由于B. velezensis 157 的内切纤维素酶基因与Bacillus sp. 3pzt.1.A 序列相似度为96.08%。因此，以3pzt.1.A序列为模板进行同源建模，3D 模型见图3。

图3 B. velezensis 157 内切葡聚糖酶的预测蛋白三级结构

信号肽分析：基于Y-Max 判定，最可能的剪切位点预测在第29 和第30 之间，第30 位为最理想的剪切位点，成熟蛋白启动的位置30 位，本蛋白具有信号肽。亲疏水性分析：经ProtScale 软件对蛋白质亲疏水性的分析发现，在13 氨基酸位点处具有1 个疏水区，在143 氨基酸位点具有1 个亲水区域。跨膜区分析：应用TMHMM 2.0 软件进行跨膜区分析，1～4 位氨基酸位于细胞内部，5～27 位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋区，28～499 位氨基酸位于细胞膜表面，表明B. velezensis 157 的内切纤维素酶可能是一个与细胞信号传导有关的膜受体蛋白。

利用Illustrator for Biological Sequences （IBS）软件内切葡聚糖酶蛋白结构进行分析。由图4 可见，5～27 氨基酸编码跨膜区域，50～297 氨基酸编码纤维素酶区域，属于糖苷水解酶GH5 家族（EC 3.2.1.4），356～437 氨基酸编码碳水化合物结合模块，其中9～445 氨基酸编码BglC 基因。

图4 B. velezensis 157 内切葡聚糖酶的蛋白结构示意图

2.2 原核表达质粒pET32a-157-CMCase 的构建与鉴定 利用纯化内切葡聚糖酶基因构建pET32a-157-CMCase质粒，经双酶切和PCR 法鉴定发现，在1 500 bp 处的条带与目的基因大小相符的条带（图5）。

2.2.1 重组内切葡聚糖酶基因表达条件的优化及可溶性分析 经IPTG 和时间诱导优化后，用SDS-PAGE 检测蛋白表达情况。从图6 和图7 可以看出，随着诱导物浓度增加表达量无明显变化，且加入0.4 mmol/L 诱导剂时菌株表达量最佳；菌株表达量最佳诱导时间为8 h。

图5 重组质粒pET32a-157-CMCase 的双酶切鉴定

图6 重组质粒pET32a-157-CMCase 诱导剂最佳浓度的SDS-PAGE 分析

图7 重组质粒pET32a-157-CMCase 诱导剂最佳时间的SDS-PAGE 分析

2.2.2 葡萄糖标准曲线及回归方程 葡萄糖标准曲线的拟合方程为y=0.462x－0.085，标准曲线的线性相关系数为0.999，符合标准曲线的要求，可以用于后续酶活力计算。

2.2.3 重组内切葡聚糖酶的胞内外分析 由图8 可见，重组pET32a-157-CMCase 蛋白在上清中可检测到纤维素酶活力为5.81 IU/mL，细菌沉淀中为1.61 IU/mL；诱导后原菌液直接超声破碎处理纤维素酶活力可达7.41 IU/mL，其酶活力为野生菌株B. velezensis 157的2.3倍（P＜0.000 1），说明重组菌株p ET32a-157-CMCase 可进行纤维素酶表达，且产生的纤维素酶主要进行分泌表达。因此，后续采用诱导后上清液可直接进行重组纤维素酶活的分析。

图8 重组内切葡聚糖酶的胞内外分析

2.2.4 重组内切葡聚糖酶的CMC 平板验证 重组pET32a-157-CMCase 蛋白能够在CMC-Na 筛选平板上生长，且经过刚果红染色后，出现明显的透明圈（图9），证明重组菌株具有分泌内切葡聚糖酶力的能力。

图9 重组内切葡聚糖酶的羧甲基纤维素钠筛选平板验证

2.2.5 重组内切葡聚糖酶的酶学性质分析

2.2.5.1 重组内切葡聚糖酶的最适反应温度、pH 以及温度和pH 的稳定性 重组内切葡聚糖酶的最适酶反应温度和p H 分别为50℃和6（图10-a 和10-c）。重组内切葡聚糖酶的温度稳定性（图10-b）结果发现，温度在40～50℃时，相对剩余酶活力均高于90%，随着温度升高酶活逐渐降低，当温度高于60℃，酶活力相对剩余酶活约为75.87%（30 min），随着作用时间的延长，酶活力下降到72.13%（60 min）。重组内切葡聚糖酶pH 稳定性（图10-d）结果发现，在p H 为5 时，相对酶活力约为86.45%左右；在p H 6～10 时耐受性良好，相对剩余酶活力均高于90%；随作用时间的延长，对相对剩余酶活力影响不大。

2.2.5.2 不同金属离子及添加剂对重组内切葡聚糖酶的影响 由表1 可知，Na+、Mg2+、Mn2+可以促进重组内切葡聚糖酶，而Co2+、Zn2+、Hg2+、Fe2+、Cu2+等金属离子抑制内切葡聚糖酶。表面活性剂SDS 和DTT 抑制重组内切葡聚糖酶。

图10 重组内切葡聚糖酶的最适反应温度（a）、pH（c）及温度（b）和pH（d）稳定性

2.2.5.3 重组内切葡聚糖酶的底物专一性 从表2 可发现，对羧甲基纤维素钠具有最高的酶活力，同时对微晶纤维素、纤维二糖、木聚糖、滤纸、水杨苷均有一定酶活力，对水杨苷酶活力利用能力最低。表明重组内切葡聚糖酶具有典型内切纤维素酶的特征。

表1 各种金属离子和化学试剂对重组内切葡聚糖酶的影响 %

表2 重组内切葡聚糖酶的底物专一性 %

3 讨 论

B. velezensis 157 是一株能够分泌多种木质纤维素酶的芽孢杆菌，包括：内切葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、果胶酶等[21]。本研究中，B. velezensis 157 的胞外内切葡聚糖酶可达3.24 IU/mL，但胞外提取物成分复杂，不利于回收，限制了其在工业上的应用。纤维素酶在外源宿主中的过表达是解决野生菌株纤维素酶产量低、难回收等问题的优良替代方法。本研究中，重组内切葡聚糖酶产量与野生菌株相比，增加了2.3 倍，说明大肠杆菌系统的重组表达水平更高，有望代替野生菌株作为细胞工厂生产纤维素酶制剂，将纤维素生物质转化为可发酵糖[24]。此外，本实验还发现胞外分泌的纤维素酶活性比胞内纤维素酶活性高，在开发重组纤维素酶方面具有关键意义。目前，胞外纤维素酶产量高且能够进行胞外分泌表达的报道有限，重组纤维素酶的开发面临困难重重。Kim 等[25]报道，B. circulans 和B. licheniformis中内切葡聚糖酶可在大肠杆菌表达系统中100%进行胞外分泌表达。与上述报道相反，Koide 等[26]对来自B. subtilis IF03034 的内切葡聚糖酶进行大肠杆菌克隆和表达，发现其胞外内切葡聚糖酶活性仅为25%。而来自B. subtilis DLG 的内切葡聚糖酶在大肠杆菌中胞外分泌表达甚至更少（约1%），且重组内切葡聚糖酶大部分存在于胞质周间或胞质膜内[27]。本实验对重组内切葡聚糖酶进行胞内外分析发现，重组内切葡聚糖酶在上清中可检测到纤维素酶活力为5.81 IU/mL，细菌沉淀中为1.61 IU/mL，诱导后原菌液直接超声破碎处理纤维素酶活力可7.41 IU/mL。本研究结果与Pandey 等[10]报道的重组一株Bacillus subtilis IARI-SP-1 的内切葡聚糖酶结果相似，其重组内切葡聚糖酶在上清中可检测到纤维素酶活力为8.2 IU/mL，细菌沉淀中为2.8 IU/mL，诱导后原菌液直接超声破碎处理纤维素酶活力可10 IU/mL。因此，说明重组Bacillus velezensis 157 的内切葡聚糖酶可进行诱导表达，且产生的纤维素酶主要进行分泌表达，从SDS-PAGE 得到的重组葡聚糖酶分子量约为55 ku，与其他芽孢杆菌报道的内切葡聚糖酶的分子量相似[28～29]。此外，重组内切葡聚糖酶能够在CMC 筛选平板上生长，且经过刚果红染色后，出现明显的透明圈，再次证明重组内切葡聚糖酶在BL21 菌株中可进行胞外分泌表达。Yang 等[28]也利用刚果红染色法验证重组pET25bcelI15 菌株的胞外内切纤维素酶活性。重组蛋白的胞外分泌生产比胞质周间或胞质膜内更具有优势。细胞外生产不需要裂解细胞外膜来获得目标蛋白，可连续生产重组蛋白。因此，大肠杆菌系统可用于细胞外生产内切葡聚糖酶，用于后续内切葡聚糖酶的表征。

本实验结果表明，重组内切葡聚糖酶的最适酶反应温度和pH 分别为50℃和6，在40～60℃具有一定的温度耐受性，在pH 6～10 范围内具有较好的pH 耐受性；重组内切葡聚糖酶温度稳定性结果发现，在60℃放置1 h，相对剩余酶活力高于70% 以上，表明重组内切葡聚糖酶具有一定的耐热性，适用于制浆行业等需要较高温度的工业化生产。但其酶的稳定性低于Yang 等[28]报道的重组Bacillus subtilis I15 的内切葡聚糖酶，在65℃放置2 h 仍可保持90%以上的相对剩余酶活力。重组内切葡聚糖酶的pH 稳定性可以看出，在p H 为5 时，相对酶活力约为86.45%左右，在p H 6～10 时耐受性良好，相对剩余酶活力均高于90%，随作用时间的延长，对相对剩余酶活力影响不大。重组内切纤维素酶p H 稳定性高于Bacillus subtilis IARI-SP-1[10]、 B. licheniformis AU01[13]、B. amyloliquefaciens DL-3[12]和B. subtilis A-53[25]等的报道。各种金属离子和化学试剂对重组内切葡聚糖酶的影响结果发现，Na+、Ca2+、Mg2+可以促进重组内切葡聚糖酶，而Co2+、Zn2+、Hg2+、Fe2+、Cu2+等金属离子和表面活性剂SDS 抑制重组内切葡聚糖 酶。Zafar[30]报道，重组Bacillus subtilis JS2004 的内切葡聚糖酶，Ca2+、Mg2+、Tween 20 能够激活重组内切葡聚糖酶酶活，而Ni2+、Hg2+、Zn2+、Cu2+以及SDS抑制其酶活力，与本实验结果相一致。重组内切葡聚糖酶的底物专一性实验发现，对羧甲基纤维素钠具有最高的酶活力，同时对微晶纤维素、纤维二糖、木聚糖、滤纸、水杨苷均有一定酶活力，表明重组内切葡聚糖酶具有典型内切纤维素酶特征，且具有利用底物广的特点。本实验结果与Hakamada 等[31]报道的Bacillus sp. KSM-S237 结果相似。

4 结 论

本实验成功将野生菌株B. velezensis 157 的内切葡聚糖酶在大肠杆菌系统中进行克隆和表达，成功构建了分泌型重组内切葡聚糖酶的大肠杆菌，并进行酶学性质分析。重组内切葡聚糖酶的分子量约为55 ku，经0.4 mmol/L IPTG 和8 h 诱导表达优化后，在培养上清、菌体以及直接超声破碎的原菌液中可检测到内切葡聚糖酶活力分别为5.81、1.61、7.41 IU/mL，为野生菌株内切葡聚糖酶的2.3 倍。重组内切葡聚糖酶具有典型内切纤维素酶的特征，其最适酶反应温度和pH 分别为50℃和6，在40～60℃具有一定的温度耐受性，在pH 6～10 范围内具有较好的pH 耐受性。Na+可以促进重组内切葡聚糖酶活力，而Co2+、Hg2+、Fe2+等金属离子以及表面活性剂SDS 具有较强的抑制作用。本实验室正试图利用纤维素酶的过表达进行大规模生产，作为纤维素酶制剂用于动物生产。预计还将进一步地进行实验条件优化，以便最大限度地将生物质材料转化为可发酵糖。