罗永光

（淮安生物工程高等职业学校，江苏淮安 223200）

芦丁（Rutin）又称芸香苷，是维生素P 的主要成分。芦丁是一种从植物中提取的黄酮类化合物，其结构是由槲皮素 C3 位上的羟基和芸香糖结合而形成的双糖苷[1]。芦丁具有抗炎、抑菌、抗病毒和抗氧化等作用，目前广泛应用于防治脑溢血、高血压、关节炎等疾病。在饲料中添加黄酮类化合物可促进畜禽生长、提高生产性能和改善繁殖性能等[2]。有研究表明，在日粮中添加适量的芦丁能够提高奶牛泌乳性能，保持乳品质，降低奶牛血清中尿素氮的水平和抑制甲烷的生成，提高血清溶菌酶的含量以及通过提高瘤胃内容物固相和液相滤纸酶、β-葡萄糖苷酶、羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶的活性来提高奶牛的消化和代谢[3-6]。另外，芦丁能够提高大鼠泌乳量，促进免疫器官胸腺和脾脏的发育[7-8]。以上表明，作为黄酮类物质的芦丁可以作为一种绿色添加剂在动物生产中应用。目前，关于芦丁对奶牛乳腺上皮细胞影响的研究未见报道，芦丁提高奶牛泌乳性能的机制尚不清楚。因此，本实验以体外细胞培养法来研究芦丁对奶牛乳腺上皮细胞的影响，为丰富相关理论提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 芦丁（含量≥98 %）由上海源叶生物科技有限公司提供，奶牛乳腺上皮细胞通过组织块培养法获得，胎牛血清和DMEM/F12 购于美国的Gibco 公司，青霉素、链霉素和谷氨酰胺购于美国的Sigma 公司，二甲基亚砜（DMSO）购于北京的索莱宝公司，RNA 提取试剂盒和反转录试剂盒购于天根生化有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将采集到的奶牛乳腺用含有双抗的PBS 进行清洗，然后根据李吉霞[9]的方法进行组织块培养法获得乳腺上皮细胞。将纯化的细胞接种在含有10% 胎牛血清、青霉素和链霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺等的DMEM/F12 培养基中， 37℃，5% CO2，饱和湿度下培养。

1.2.2 细胞活性 采用噻唑蓝（MTT）法进行细胞活性的检测，将细胞密度调整到1×105个/mL 后接种到96 孔板中，分别在基础培养基中分别加0、25、50、100、150 μg/mL芦丁（溶于二甲基亚砜，二甲基亚砜含量为1‰），每组5 个重复。细胞于37℃，5% CO2培养箱中培养48 h和96 h 后，分别在每孔中加入20 μL 0.5% MTT，放回培养箱中继续培养4 h，然后去除培养液，用PBS 冲洗2 遍，每孔加入DMSO 150 μL 于摇床混匀10 min，最后在490 nm 下测定OD 值。

1.2.3 抗氧化指标的测定 将细胞密度调整到1.5×105个/mL接种到12 孔板，分组同1.2.2，每组4 个重复。细胞于37℃、5% CO2培养箱中培养48 h 和96 h 后，然后参照南京建成试剂盒上的方法检测乳酸脱氢酶（LDH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量。

1.3 细胞凋亡基因表达的测定

1.3.1 RNA 的提取 将细胞密度调整到5×105个/mL 接种到12 孔板，分组同1.2.1，每组4 个重复。细胞于37℃、5% CO2培养箱中培养96 h 后，弃除培养基，在6 孔板中加入1 mL 的RZ 裂解液裂。RNA 的提取方法参照试剂盒中的说明书，提取的RNA 经过浓度和纯度的检测后进行反转录，操作方法参照试剂盒中的说明书。将cDNA 保存在-20℃冰箱待测。

1.3.2 RT-PCR 条 件 反 应 体 系 为 20 μL：Master Mix (2×) 10 μL，上、下游引物 (10×)各1 μL，cDNA 5 μL，无酶水3 μL。反应条件为95℃ 预变性10 min；PCR 反应为95℃、10 s，退火60℃和72℃延伸各10 s，循环45 次；融解曲线分析65℃、60 s。

1.3.3 引物设计 根据GenBank 中的基因序列设计引物，由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成，β-actin 为管家基因。引物设计见表1。

1.4 统计分析 数据先用Excle 2010 预处理，然后采用IBM SPSS 21.0 软件进行单因素方差分析（ANOVA），LSD 法进行多重比较，结果以平均值± 标准差表示， P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 芦丁对乳腺上皮细胞活性的影响 由表2 可知，48 h时，100 μg/mL 和150 μg/mL 芦丁组的细胞活性显著高于0 μg/mL 和25 μg/mL 芦丁组，而在96 h 时，50～150 μg/mL芦丁组的细胞活性显著高于0 μg/mL 芦丁组。结果说明，芦丁能够促进细胞的增殖，其中添加100 μg/mL 芦丁的效果最好。

2.2 芦丁对乳腺上皮细胞抗氧化性指标的影响 由表3 可知，48 h 时，100 μg/mL 芦丁组细胞的GSH-Px 和CAT活性显著高于0 μg/mL 和25 μg/mL 芦丁组，0 μg/mL 芦丁组的MDA 含量和LDH 活性均显著高于其他各组，而各组的SOD 活性没有显著差异；在96 h 时，0 μg/mL 芦丁组的GSH-Px 活性和SOD 活性显著低于100 μg/mL和150 μg/mL 芦丁组，而MDA 含量和LDH 活性均显著高于100 μg/mL 芦丁组，50 μg/mL 芦丁组的CAT 活性显著高于其他组，150 μg/mL 芦丁组CAT 活性最低。结果表明，芦丁能够提高抗氧化酶活性，进而提高细胞的抗氧化能力，其中添加100 μg/mL 芦丁的效果最好。2.3 芦丁对乳腺上皮细胞凋亡基因表达的影响 由表4可知，100 μg/mL 芦丁组乳腺上皮细胞的Bcl-2 表达显著高于其他组，其他各组之间差异不显著；0 μg/mL 芦丁组细胞的Caspase3 表达显著高于其他组，100 μg/mL和150 μg/mL 芦丁组细胞的P53 表达显著低于其他组。结果表明，芦丁能够通过影响凋亡相关基因的表达来抑制细胞的凋亡，其中添加100 μg/mL 芦丁的效果最好。

3 讨 论

刘春龙等[10]研究发现，添加10、100 ng/mL 染料木素和添加100、1 000 ng/ mL 大豆黄酮均能够显著促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖。穆莹等[11]研究发现，添加10～1 000 mg/L 大豆异黄酮能显著增强奶牛乳腺上皮细胞增殖能力与活力。另外，苜蓿黄酮也能够促进体外培养奶牛乳腺上皮细胞的增殖[12]。以上结果表明，黄酮类化合物能够促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖。本实验中，细胞培养48 h 和96 h 时，添加100～150 μg/mL 芦丁均能够显著提高奶牛乳腺上皮细胞的活性。可见添加适量的芦丁能够促进奶牛乳腺上皮细胞增殖。芦丁的结构与内源性雌激素17-β-雌二醇相似，能够与雌激素受体竞争性地结合，发挥弱雌激素效应，进而升高生长激素、胰岛素样生长因子和催乳素水平，促进乳腺发育并提高产奶量[13]。因此，芦丁促进奶牛乳腺上皮细胞增殖可能与它发挥弱雌激素作用有关。

表1 引物设计

表2 芦丁对乳腺上皮细胞活性（OD 值）的影响

表3 芦丁对乳腺上皮细胞抗氧化指标的影响

表4 芦丁对乳腺上皮细胞相关基因表达的影响

卢志勇等[14]研究发现，添加大豆异黄酮能够提高奶牛乳腺上皮细胞SOD、GSH-Px 和 CAT 活性，降低MDA、NO 含量。王振云等[15]研究发现，茶多酚可能通过降低 MDA 含量，增强 SOD 活性来保护奶牛乳腺上皮细胞氧化应激损伤。苏效双等[12]研究发现，添加苜蓿黄酮能够提高奶牛乳腺上皮细胞GSH-Px 和 CAT 活性，降低LDH 活性和MDA 含量。本实验也发现，添加100 μg/mL 芦丁能提高奶牛乳腺上皮细胞的GSHPx 、SOD 和CAT 活性，降低LDH 活性和MDA 含量。结果说明，添加适量的芦丁能够提高细胞的抗氧化性能。芦丁作为一种黄酮类化合物，可能从以下几方面来发挥抗氧化作用：①在氧化过程中，释放H+直接能够与自由基相结合，进而清除自由基；②与金属离子螯合，降低金属离子诱导产生的氧自由基；③抑制脂肪氧合酶、NADH 氧化酶等氧化酶的活性，降低超氧化阴离子的产生[16]。

Caspase 3 被认为是凋亡的关键蛋白酶，当其被激活时必然会发生细胞凋亡，因此发生细胞凋亡时，会先活化Caspases 蛋白酶，进而介导蛋白裂解。Bcl-2 基因是一种具有抑制凋亡的癌基因，能够阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质，从而抑制了细胞凋亡。P53 作为抑癌基因之一，是细胞内的转录因子，在正常状态下其表达较低。P53 通过激活细胞凋亡受体Fas、Bax、Noxa、Puma、Apaf-1 以及线粒体膜上的Bcl-2、Bcl-xl 和Mcl-1 等凋亡相关基因的转录来诱导细胞凋亡。张锦等[17]研究芦丁对H2O2诱导心肌细胞凋亡的作用发现，芦丁能够通过上调Bcl-2 蛋白的表达，下调Bax 蛋白的表达，进而发挥抗氧化作用，抑制细胞凋亡。王丽伟等[18]发现，芦丁能够通过上调Bcl-2 蛋白的表达，下调Bax 蛋白的表达和抑制Caspase 3 蛋白的活化来发挥对心肌细胞的保护。研究发现，葛根异黄酮能够下调甲基-苯基-吡啶离子诱导的帕金森病细胞模型P53 mRNA 的表达；在1-甲基-4-苯基-吡啶离子的诱导下，葛根素能够通过下调人神经母细胞瘤细胞的P53 mRNA 的表达来保护细胞[19-20]。以上结果说明，黄酮类化合物能够通过调控Bcl-2、Caspase 3 和P53 的表达来保护细胞。本研究也发现，添加100 μg/mL 芦丁能够上调Bcl-2 的表达和下调P53 和Caspase 3 的表达。另外，添加100 μg/mL芦丁组的细胞活性最高。结果说明，添加适量的芦丁能够抑制细胞凋亡，促进细胞增殖。

有些黄酮类化合物不仅能够保护DNA 免受氧化损伤，但也能诱导DNA 损伤。黄酮是否促氧化性还是抗氧化性，主要取决于黄酮的浓度。另外，金属离子是黄酮表现抗氧化性还是促氧化性的一个重要因素[21]。本研究发现，添加量大于100 μg/mL 芦丁组细胞活性、细胞内抗氧化酶活性均有所下降，促细胞凋亡基因的表达有所增加。说明添加高剂量芦丁对细胞的增殖有负面作用。原因可能是高浓度的芦丁螯合金属离子数量多，进入细胞后释放出的金属离子表现出促氧化的作用，进而导致细胞产生自由基，促进细胞凋亡，降低细胞活性。

4 结 论

芦丁能够通过提高细胞的抗氧化能力和抑制细胞凋亡来提高奶牛乳腺上皮细胞的活性。从本实验条件下，培养基中添加100 μg/mL 芦丁的效果最佳。