王 硕，李雁冰，黄大鹏，李井春，魏国生

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）

目前猪人工授精技术中的精液长期保存被广泛重视[1]。常温保存为猪精液的主要保存方式，可利用时间一般只有3 d[1]，易造成资源浪费。相对于其他畜禽，猪冷冻精的技术应用较少[2]，4℃保存不仅保存时间较长且对猪精子损伤较小，研究精液4℃保存具有重要意义。

猪精子在低温易引起“冷休克”[3]，因此抗低温保护剂的选择尤为重要。保护剂可结合细胞内外的水，使液态环境黏性上升，降低溶液中电解质的浓度和渗透压等作用[4-5]，达到保护精子的目的。甘油是广泛应用的冷冻保护剂，但具有一定毒性。Sánchez-partida 等[6]研究表明，有甘油的稀释液中精子运动性比没有甘油更好。乙二醇活性较强，在一定条件下易产生酸类，造成精子损伤，而甘油较稳定。孙时军等[7]研究发现，在4℃下采用1%乙二醇对精子活率的保护效果最好。本实验在Modena 基液中添加不同比例的乙二醇和甘油，同时采用负压处理，通过检测精子活率、直线速度、路径速度、畸形率、鞭打频率参数，探究组合剂对精液的保存效果，为猪精液的4℃保存研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 甘油（吉林省军区化工厂生产）；乙二醇（天津市大茂化学试剂厂生产）；每1 升Modena 稀释液中含：葡萄糖 27.50 g；NaHCO31 g；TRIS 5.65 g；柠檬酸 2.9 g；柠檬酸钠 6.9 g；EDTA-2Na 2.6 g；青霉素 0.074 g；链霉素 0.05 g；BSA 4 g。Modena 稀释液药品成分均购自西格玛公司。

1.2 精液来源 猪精液采自黑龙江八一农垦大学猪场，采集3 头健康无病长白种公猪混合精液，年龄为2～3 岁。无异味、色泽为乳白色、精子活力在0.7 以上的精液。

1.3 实验设计 将稀释后精液分成6 组，添加抗冻剂分 别 为0.00%+0.00%（ 对 照 组）、0.50%+0.50%、0.75%+0.25%、0.25%+0.75%、0.00%+1.00%、1.00%+0.00%的甘油和乙二醇，每组设3 个重复实验，各组稀释液有效羟基含量分别为0.00×10-2、3.13×10-2、22.77×10-2、27.10×10-2、36.13×10-2、42.40×10-2mol/L。检测不同保存时间段的精子质量参数。

1.4 实验方法

1.4.1 猪精液的稀释 原精液采集后1～2 h 内运输到实验室，采用精板计数法检测原精液的精子密度，用添加乙二醇和甘油的Modena 基础稀释液进行稀释，稀释后密度为1×108个/mL。

1.4.2 精液4℃保存处理 将稀释后的各组放入负压瓶中，通过真空泵将其压强调整至负压 0.04 MPa，用数层纱布包裹，转入17℃的恒温箱内降温平衡1.5 h，再转入4℃恒温箱内，降温过程平稳缓慢。每隔12 h 对精液缓慢混匀，避免精子沉聚而损伤。

1.4.3 精子质量参数的检测 根据实验设计，在保存的各时间段（1、3、5、7、9、11、13 d）定时取样，样品需在37℃培养箱中复苏15 min，通过迈朗全自动精子分析仪检测精子活率、路径速度、直线速度、鞭打频率、畸形率等质量参数，并记录实验数据。

1.5 统计分析 利用 StatView 5.0 软件对实验测定的各项参数进行方差分析和多重比较，实验结果用平均值±标准差来表示。P＜0.05 为差异显著性判定标准。

2 结 果

2.1 不同抗冻剂配合对精子活率的影响 由表1 可知，随着保存天数的增加，各组精子活率呈逐渐下降趋势。相对于实验组，对照组精子活率的下降速度较快，1 d 后精子活率低于其他组（P＜0.05）。保存13 d 时仅0.25%+0.75%、1.00%+0.00%组精子有活率，其中，1.00%+0.00%组精子活率在9～13 d 高于除0.25%+0.75%之外的3 个实验组（P＜0.05）；5 个实验组中，0.25%+0.75% 组在9～13 d的精子活率高于0.50%+0.50% 组和0.75%+0.25% 组（P＜0.05）；0.75%+0.25%组在保存9～11 d 的精子活率高于0.50%+0.50%组（P＜0.05）。精子活率基本符合“有效羟基”含量越高保存效果越好的原理。

2.2 不同抗冻剂配合对精子路径速度的影响 由表2 知，对照组1 d 后精子路径速度大幅度下降，且显著低于各实验组，而各实验组下降速度缓慢。1.00%+0.00%组在1～13 d的精子路径速度高于其他组（P＜0.05）。在实验组中，0.25%+0.75%组在7～13 d 的精子路径速度高于0.50%+0.50%、0.75%+0.25% 组（P＜0.05）；0.75%+0.25%、0.00%+1.00%组在7～11 d高于0.50%+0.50%组（P＜0.05），但两者无显著差异；0.25%+0.75% 组在11～13 d 高于0.00%+1.00% 组（P＜0.05），且13 d 时0.00%+1.00%组无速度。

表1 不同抗冻剂配合对精子活率的影响 %

表2 不同抗冻剂配合对精子路径速度的影响 μm/s

2.3 不同抗冻剂配合对精子直线速度的影响 由表3知，对照组的直线速度在1 d 后就大幅度下降，且低于各实验组（P＜0.05）。1.00%+0.00% 组在1～13 d 的直线速度高于其他各组（P＜0.05），且在13 d 时仍有速度。5 个实验组中，0.25%+0.75% 组在9～13 d 的直线速度高于0.50%+0.50%、0.75%+0.25%组（P＜0.05）；0.75%+0.25%组在7～11 d高于0.50%+0.50%组（P＜0.05），且这2 组13 d 时都无速度；0.25%+0.75%组在11～13 d高于0.00%+1.00% 组（P＜0.05）。0.00%+1.00% 组 在5～11 d 高于0.50%+0.50% 组（P＜0.05），在9～11 d 高于0.75%+0.25%组（P＜0.05）。

2.4 不同抗冻剂配合对精子畸形率的影响 由表4 可知，各组精子畸形率随着保存天数的增加呈逐渐上升趋势。其中，对照组在2～11 d 的畸形率高于各实验组（P＜0.05）。5 个实验组中，1.00%+0.00%组在11～13 d 的精子畸形率低于其他实验组（P＜0.05）；0.00%+1.00%组在3～13 d低于0.50%+0.50%、0.75%+0.25%组（P＜0.05），0.75%+0.25%组在11～13 d 低于0.50%+0.50%组（P＜0.05）；0.00%+1.00%组在9～13 d 低于0.50%+0.50%、0.25%+0.75%组（P＜0.05），而0.25%+0.75%组在3～13 d 低于0.00%+1.00%组（P＜0.05）。

2.5 不同抗冻剂配合对精子鞭打频率的影响 由表5可知, 各组精子鞭打频率随着保存天数的增加呈逐渐下降趋势。对照组的鞭打频率从1 d 后低于各实验组（P＜0.05）。5 个实验组中，0.50%+0.50%、0.75%+0.25%组间的鞭打频率差异不显著；0.00%+1.00%组在9～13 d低于0.25%+0.75%、1.00%+0.00%组（P＜0.05）；1.00%+0.00%组在13 d 高于0.25%+0.75%组（P＜0.05）。

表3 不同抗冻剂配合对精子直线速度的影响 μm/s

表4 不同抗冻剂配合对精子畸形率的影响 %

表5 不同抗冻剂配合对精子鞭打频率的影响 HZ

3 讨 论

本实验采用负压处理，可有效降低精液内的含氧量，减缓精子代谢过程，也可抑制微生物的滋生，从而降低对精子的损伤以及疾病的传播。由于乙二醇活性较强，低氧环境可减缓乙二醇的变质过程，可减少酸类物质对精子的损伤。

本实验选用的Modena稀释液对精液保存效果良好[8-9]。甘油与乙二醇是良好的抗冻剂，最初是Polge 等[10]发现甘油对牛精子具有抗冻保护作用，以此家畜精液长期保存技术有了重大突破。保护剂的羟基与水之间以氢键的形式键合，使溶液粘稠度升高，同时保护剂可以冲淡溶液中溶质盐浓度和渗入细胞内，降低摄入精子的盐量，调节胞内过冷状态，从而缓解细胞脱水皱缩的程度及速度[11]。本实验结果表明，各项质量参数均显示0.25%甘油+0.75%乙二醇组的精子保存效果较好，但1%甘油组的保护效果优于0.25% 甘油+0.75% 乙二醇组，0.25% 甘油+0.75% 乙二醇组优于1% 乙二醇组，说明甘油与乙二醇不同比例组合会弱化保护作用，可能是2种保护剂分子键合所致。高才等[12]研究表明，甘油与乙二醇的羟基除了与水键合外，自身也有键合，从而会弱化与水键合的效果。溶液中“羟基浓度”近似相等时乙二醇的未结冰水略高于甘油，说明2 种保护剂在水溶液中有着复杂的溶质与溶剂、溶剂与溶剂、溶质与溶质之间的相互作用，溶质结合水的能力确实与溶质中的羟基含量有定量的关系。根据相似相溶等原理分析推测，乙二醇与甘油首先键合会造成有效羟基量减少，从而弱化对精子的保护作用。本实验中，0.25% 甘油+0.75%乙二醇组的有效羟基含量低于1%乙二醇组，在9 d 之后保存效果优于1% 乙二醇组，从抗冻剂组成来看1%乙二醇组乙二醇含量高于0.25% 甘油+0.75% 乙二醇组，表明乙二醇活性较强，若保存不当易产生酸类，造成精子损伤，而甘油较稳定，pH 变化可能是0.25%甘油+0.75%乙二醇组保存效果显著高于1%乙二醇组的原因。本实验与孙时军等[7]在7 d 时1%乙二醇组的精子活率优于1%甘油组的结果不同，本实验在7 d 时1%乙二醇组与1%甘油组的精子活率差异不显著，7 d 后1%甘油组显著优于1%乙二醇组，并且直线速度指标在1 d后1%甘油组显著优于1%乙二醇组。

甘油会导致胞体膜损伤和顶体膜的穿透能力改变。本实验保护剂总浓度为1%，低于冷冻保存甘油含量对精子损伤较低。李青旺等[13]研究表明，乙二醇用于冷冻保护剂，精子尾部畸形较多，顶体较少，而甘油引起精子尾部畸形较少，顶体较多。曾维斌等[14]研究发现，将甘油与乙二醇组合使用既可保护冷冻精液中精子顶体又保护其尾部。本实验中，1%乙二醇组的路径速度与直线速度显著低于1%甘油组，可能是乙二醇引起精子尾部异常所致。随着处理时间的延长，部分精子的质膜损伤，造成精子难以承受渗透压变化，使细胞内部机制ATP 供应不足，致使精子运动形式变化和运动性能丧失[15]。

4 结 论

本实验结果显示，在精液基础液中添加一定量的甘油和乙二醇在4℃负压环境下可显著提高猪精子的活率、路径速度、直线速度、鞭打频率，降低精子畸形率，其中，1% 甘油组对精液保存效果最好，0.25% 甘油+0.75%乙二醇组保存效果优于其他组合组和1%乙二醇组，且甘油与乙二醇分子间有相互作用关系，如果按量因子，目前实验可分析二者互作效应。