宋素芳，宋幸辉，蔺成刚，李东华，王鑫磊，孙桂荣

（1.河南牧业经济学院动物科技学院，河南郑州 450002；2.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002）

羽色是家禽最显著的表型特征之一，在家禽育种中是一个重要的育种性状。“豫粉1 号”蛋鸡H 系具有浅芦花羽色性状，成年鸡颈部背部毛色为浅芦花羽色，颈腹侧为白色羽毛，具有伴性遗传特点，可作为羽色自别雌雄的重要分子遗传标记。浅芦花羽色性状作为“豫粉1 号”蛋鸡的典型特征备受育种者关注，然而调控浅芦花羽色性状的基因一直尚未确定。

膜相关转运蛋白SLC45A2（Solute Carrier Family 45 Member 2）是SLC45A（Solute Carrier Family 45）游离载体家族成员之一[1]，是一种调节黑色素合成的转运蛋白，在黑色素生成中发挥重要作用[2]。SLC45A2基因的突变影响酪氨酸酶的加工，导致人类的眼、皮肤白化病[3-4]。SLC45A2 基因的突变在狗[5]、马[6]、鹌鹑[7]、鸡[2]、鼠[8]等动物中也会引起色素沉着的变化。目前，对于浅芦花羽性状的研究还比较少，从遗传角度揭示该性状的遗传规律和调控机制，对于家禽育种工作具有十分重要的意义。本实验旨在通过研究SLC45A2 在“豫粉1 号”蛋鸡H 系不同部位毛囊中的表达量以及在黑色素细胞中添加不同浓度的酪氨酸对SLC45A2 表达量的影响，并对SLC45A2 进行生物信息学分析，为“豫粉1 号”H系浅芦花羽色性状的分子遗传学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 随机选取发育140 d 的成年“豫粉1 号”H系母鸡（由河南农业大学种鸡站提供）6 只，实验组为颈部背侧组（颈背侧具有黑白相间的芦花色羽毛），对照组为颈部腹侧组（颈腹侧白色羽毛）。人工将鸡颈部背侧和腹侧羽毛进行拔毛，强制换羽，到10 d 待其长出新的羽毛后进行样品采集，用尖头手术眼科镊子轻轻提起羽毛，剪刀连其周围的皮肤剪掉（注意要保留完整毛囊，周围皮肤和皮下组织尽量少取），放入装有RNA 保存液的1.5 mL 去RNA 酶离心管中，而后迅速放入液氮中冷冻，置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 实验仪器及试剂 紫外分光光度计（NanoDro）、凝胶成像仪 SYNGENE GBOX（美国），荧光定量仪（罗氏）、台式高速冷冻离心机Neofuge 23R（台湾力康）、Trizol（TaKaRa 公司）、氯仿、异戊醇、无水乙醇、三羟甲基氨基甲烷（Tris-Cl）、2×Taq PCR Master Mix（北京康为世纪生物科技有限公司）、灭菌的超纯水、反转录试剂盒（PrimerScriptTMRT reagent Kit，TaKaRa公司）、Agarose 琼脂糖（西班牙进口），鸡黑色素细胞，Medium254（Gbico），人黑色素细胞生长添加物（HMSG，Gbico）。

1.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）引物设计与合成 根据NCBI 上的鸡SLC45A2（NM_001083364.2）序列，使用NCBI 在线数据库设计引物（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?ORGANISM=9031&INPUT_SEQUENCE=NM_001083364.2&LINK_LOC=nuccore），主要参数为产物的大小在200 bp 左右，退火温度55～65℃，上、下游引物大小在20 bp 左右，所设产物至少横跨1 个内含子。内参基因β-actin 的引物序列由河南农业大学家禽种质资源创新工程研究中心提供，引物设计完成后由上海生工生物工程有限公司合成。引物信息见表1。

表1 实时荧光定量PCR 引物信息

1.4 鸡黑色素细胞SLC45A2 验证 第4 代对数生长期的鸡黑色素细胞，设置培养基分为不添加酪氨酸组和分别添加10-9、10-8、10-7、10-6mol/L 酪氨酸培养基，分别培养黑色素细胞，接种于6 孔板，每组3 个重复孔，重复3 次。置于5% CO2，37℃培养箱中培养72 h 后收取细胞。

1.5 RNA 提取与反转录 采用Trizol 的方法进行毛囊组织和黑色素细胞RNA 的提取，利用微量紫外分光光度计测定RNA 浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳进行RNA完整性检测。质量良好的RNA，参考TaKaRa 反转录试剂盒说明书的操作步骤进行反转录反应。

1.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）反应 采用Roche LightCycler 96 实时荧光定量系统（罗氏，瑞士）和SYBR Green I 染料法进行qPCR，用管家基因β-actin 作为内参，每个样品3 个技术重复。20 μL 反应体系：2×SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），cDNA 2 μL（500ng/uL），加双蒸水至20 μL。反应程序：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，40 个循环。

1.7 统计分析 用2-ΔΔCt法来计算目的基因的相对表达量，采用SPSS 21.0 软件对数据分别进行独立样本t 检验，单因素方差分析；用GraphPad Prism7.0 软件作图。结果表示为平均值±标准差。

1.8 SLC45A2 基因编码蛋白的生物信息学分析 依据NCBI 提供的BLAST 程序查找SLC45A2 基因编码蛋白序列；氨基酸翻译使用SDSC Biology Workbenc；氨基酸序列的信号肽预测使用Signal P Server 4.1；跨膜域预测使用TMHMM Server v. 2.0，预测SLC45A2 基因的理化性质和疏水性。

2 结果与分析

2.1 不同部位羽色基因SLC45A2 的表达分析 如图1所示， SLC45A2 在颈部背侧浅芦花羽色的表达量显著高于腹侧白色的表达量。

图1 SLC45A2 在颈部背侧和腹侧的相对表达量

2.2 黑色素细胞中添加不同浓度酪氨酸对SLC45A2 表达量的影响 由图2 可知，与对照组相比，黑色素细胞中添加10-9、10-8mol/L 酪氨酸使SLC45A2 表达量显著增高，浓度为10-8mol/L 时 SLC45A2 表达量最大。说明黑色素细胞中添加酪氨酸可以促进SLC45A2 表达，10-8mol/L 是酪氨酸在黑色素细胞中促进SLC45A2 表达的最大添加剂量；但超过10-8mol/L 引起SLC45A2的表达量显著下降，与空白对照组差异不显著。

图2 添加不同浓度酪氨酸黑色素细胞中SLC45A2 的表达量

2.3 SLC45A2 的信号肽 由图3 可知，C 值（原始剪切位点得分）为0.110，S 值（信号肽分数）为0.138，Y 值（被结合的剪切位点的分数）为0.109，不符合1个典型信号肽（S 值在切割位点之前高，而在切割位点之后降低，C、Y 值趋向于+1）的标准，暗示鸡的SLC45A2 不存在信号肽。

图3 SLC45A2 基因的信号肽

2.4 SLC45A2 基因的跨膜区 如图4 所示，SLC45A2存在12 个跨膜区，编码蛋白为跨膜蛋白。

图4 SLC45A2 基因的跨膜区

2.5 SLC45A2 的疏水性 如图5 所示，第246 位氨基酸得分最高为3.789，说明在该位点的疏水性最强；第478 位氨基酸得分最低为-2.856，表示该位点的亲水性最弱。整条多肽链呈现为疏水性，因此可以判断SLC45A2 基因编码蛋白为不可溶性蛋白。

3 讨 论

“豫粉1 号”蛋鸡是河南农业大学2015 年培育出的新的配套系，该品种是国内唯一的土种蛋鸡羽速、羽色双自别雌雄配套系，充分利用了矮小和浅芦花羽基因的伴性遗传。“豫粉1 号”蛋鸡的浅芦花羽色性状作为品种的典型特征备受育种者关注，通过查阅资料及前人的研究结果，筛选出了控制羽色性状的候选基因SLC45A2。

图5 SLC45A2 基因的疏水性

本实验发现SLC45A2 基因在“豫粉1 号”蛋鸡H 系颈部的不同羽色的表达量存在显著差异，说明它与“豫粉1 号”蛋鸡H 系浅芦花羽色的形成相关。Qiu 等[4]研究表明SLC45A2 的突变和白化病有关。王海东等[9]认为，SLC45A2 在不同毛色小鼠皮肤中的表达存在差异性，以及 过 表 达SLC45A2 后MITF、TYR、TYRP1、TYRP2以及黑色素含量都发生明显变化，表明SLC45A2 通过调节黑色素的生成进而参与毛色的形成。Wei 等[10]研究表明，SLC45A2 在1 月龄灰、白羽朗德鹅皮肤中显著差异表达，SLC45A2 基因在黑色素生物合成过程中发挥作用。

黑色素是影响动物羽色形成的主要物质基础，黑色素受一系列相关基因的复杂调控和外在因素影响，进而影响黑色素的沉积和分布。大量研究表明，黑色素的合成主要是酪氨酸在酪氨酸酶的作用下，经过一系列的生物化学反应而形成的，以不同的形式在动物体表现出来。本实验结果表明黑色素细胞中添加酪氨酸后，SLC45A2表达量增加。SLC45A2 表达量在酪氨酸添加剂量为10-8mol/L 时达最高，之后随着浓度的增加，SLC45A2的表达量反而有所降低，这说明SLC45A2 在黑色素细胞中的表达对酪氨酸存在一定的剂量依赖关系。同时也说明黑色素细胞中添加不同浓度的酪氨酸可以影响浅芦花羽色的形成，但具体的调控机制还需要进一步研究。

综上所述，SLC45A2 在“豫粉1 号”不同羽色中的表达存在差异，黑色素细胞中添加酪氨酸后SLC45A2 的表达量上升，表明SLC45A2 通过调节黑色素的生成进而参与毛色的形成，为SLC45A2 参与毛色形成的分子基础提供新的依据。通过生物信息学对SLC45A2 信号肽、跨膜区和疏水性等方面进行分析，表明该基因为跨膜蛋白、不可溶性蛋白，为进一步从蛋白水平研究其生物学功能提供参考。