任海燕　弓桂花　王永康　赵爱玲　薛晓芳

摘要：为深入研究枣体细胞胚胎发生的形态建成过程，以‘小梨枣’幼胚为材料，采用苏木精-伊红法染色和石蜡切片技术对体细胞胚发生、发育进行了组织学观察。结果表明：胚型愈伤组织细胞体积小，细胞核大，细胞质浓，细胞排列紧密;而非胚性愈伤组织细胞体积大，细胞核小，细胞质稀薄。体细胞胚产生于幼胚愈伤组织的表层细胞或内部细胞，且发生不同步，其发育过程与合子胚发育过程相似，即经历球形期、心形期和鱼雷期，最终形成子叶形胚。

关键词：枣;幼胚;体细胞胚;组织学观察

中图分类号：Q    文献标志码：A    论文编号：cjas18050007

Somatic Embryogenesis and Development in Ziziphus jujuba Mill.： Histological Observation

Ren Haiyan1，2， Gong Guihua1， Wang Yongkang1， Zhao Ailing1， Xue Xiaofang1

（1Institute of Pomology， Shanxi Academy of Agricultural Science/The Key Research Team of Genetic Improvement and Utilization of Jujube Resource/Shanxi Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Use of Pomology， Taigu 030815， Shanxi， China; 2School of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， Shanxi， China）

Abstract： The paper aims to study the morphogenesis process of somatic embryogenesis. We used young embryos of Ziziphus jujuba ‘Xiaolizao’ as explants， and carried out the histological observation of somatic embryo formation and development by using the method of hematoxylin-eosin staining and paraffin section. The results indicated that： the embryogenic callus cells had the characteristics of small size， large nucleus， thick cytoplasm and the cells were closely arranged; however， the non- embryogenic callus cells were characterized with large size， small nucleus and thin cytoplasm. The somatic embryos were originated from surface calluscells and inner calluscells of immature embryos and their development were not synchronized which was similar to the embryonic development process of zygotes， the somatic embryos also experienced the spherical stage， the heart-shaped stage， the torpedo stage and ultimately formed cotyledon embryos.

Keywords： Chinese Jujube; Young Embryo; Somatic Embryogenesis; Histological Observation

0 引言

体细胞胚或胚状体的发生，最初在1958年Steward利用胡萝卜韧皮部组织，诱导愈伤组织，通过液体培养产生具有胚胎结构的组织。体细胞胚胎发生多具有单细胞起源的特点，且高效稳定的体细胞胚发生系统对于基因工程、遗传转化、品种改良等方面的研究都具有十分重要的意义。

目前，虽有一些关于枣胚经体细胞胚发生获得植株的研究报道，如陈维伦等[1]对酸枣胚进行无性胚状体发生并获得植株;李登科等[2]对六月鲜枣幼胚进行离体培养，成功获得了胚状体及再生苗;张存智[3]以胚龄50～60天陇东马牙枣为试材成功诱导出胚状体及再生苗植株。从已有报道来看，幼胚较适宜作为体胚发生的外植体，但关于枣体细胞胚发生发育的组织学观察研究较少，特别是以幼胚为外植体方面的研究。目前仅见郝建平等[4]对‘晋矮1号’等枣合子胚和体细胞胚发育过程进行了观察与比较;程佑发等[5]对‘临泽小枣’子叶体细胞胚发生和组织学研究。本研究以‘小梨枣’幼胚为材料，运用石蜡切片，从组织学方面对枣体细胞胚胎发生过程中的细胞形态、组织结构方面的差异进行了研究，以揭示枣幼胚体细胞胚胎的发育过程，以期为枣幼胚体细胞胚胎发生提供细胞水平证据。

1  材料与方法

1.1 试验时间、地点

本試验于2013—2015年在山西省农业科学院果树研究所国家枣资源圃进行。

1.2 试验材料

供试材料‘小梨枣’为可育率较高的枣品种，其盛花期为6月上旬，期间选取黄蕾期开放的枣花挂牌标记为定花，由定花所结得果为定果，根据定花和定果确定胚龄。选取胚龄30～40天的幼果。

将采集的幼果带回实验室，流水冲洗1h，75%酒精浸泡30s，无菌水洗2次，再用0.1%HgCl2振荡3min，无菌水洗5次，用手术刀将枣果剖开，取出胚珠，剥去外表皮后以合点端插入培养基的竖放方式接种在培养基中，所有操作均在超净台上进行。培养温度为24℃±2℃，光照时间14h/d，光照强度3000 lx。

1.3 试验方法

1.3.1 胚乳看护培养 将‘小梨枣’胚珠置于胚乳看护培养基MS+IBA0.2mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+LH0.5g/L+蔗糖7%+琼脂5.5g/L，pH调至5.8，培养30天，获得可见幼胚。

1.3.2 愈伤组织诱导 将获得的幼胚接种于MS+TDZ0.6mg/L+IBA1.5mg/L+NAA0.1mg/L，培养40天，诱导胚性愈伤组织。

1.3.3 体细胞胚的发生与成熟 将挑取的胚性愈伤组织接种于MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.02mg/L，培养20天，诱导产生原胚，转接于MS+ABA0.5mg/L的培养基中，培养20天。

1.3.4 体细胞胚发育过程的组织形态学观察 将上述胚性细胞诱导和体细胞胚发育过程中获得的材料用FAA固定液固定，石蜡切片法制片。切片厚度9μm，采用苏木精-伊红法染色。于Olympus CXA1型系统显微镜下观察。

2  结果与分析

2.1 体细胞胚发育过程的观察

胚龄30天的胚珠外表皮呈白色，易剥离，胚不可见，胚乳呈透明液体状。胚龄40天的胚珠表皮呈黄白色，有韧性，胚乳呈乳白色，半透明半固体状，经胚乳看护培养，形成可见的球状体幼胚（见图1A）。

将球状体的幼胚（见图1B）转接进行愈傷组织诱导，10天后幼胚膨大、表面变为粗糙，25天后表面可见许多凸起的细胞团，呈不规则形态，并开始出现愈伤组织，颜色为黄白色。幼胚培养34天后一些幼胚表面产生的愈伤组织整体为乳黄或淡黄色，质地紧密，呈团块装，为非胚性愈伤组织（见图1C）。多数愈伤组织中形成淡黄色、半透明颗粒状、质地疏松，易分离的胚性愈伤组织（见图1D）。体细胞胚经圆胚团阶段、随着极性结构的形成，体细胞胚不断发育，球体不断膨大，胚性头部扩展伸长，形成棒状体（见图1E）。棒状体进一步发育，头部形成子叶原基凸起，随后子叶原基发育成幼小子叶（见图1F）。随着体细胞不断的成熟，子叶不断发育和生长变绿，顶端胚芽开始生长，胚根伸长，体胚萌发成再生植株（见图1G）。

2.2 体细胞胚的发生发育的组织学观察

枣幼胚体细胞胚以间接方式发生，即先由幼胚脱分化产生愈伤组织，再从愈伤组织上分化形成体细胞胚。

组织学观察表明，愈伤组织细胞主要有两类，一类细胞排列松散而核小，细胞壁薄，细胞质稀薄，液泡化，含水量大，细胞体积较大，形状不规则，多为长形、长椭圆形，从石蜡切片观察看染色较浅，这类排列松散的细胞称为非胚性细胞（见图1H）。非胚性愈伤边缘的细胞通过活跃的分裂活动、快速的分裂和增殖，可以转化为胚性愈伤组织细胞。另一类细胞多位于从表面或表层细胞的分生中心，与非胚性细胞相比，这类细胞细排列紧密，胞壁较厚，细胞核大而明显且多位于细胞中央，细胞质浓，细胞内通常积累大量的营养物质，体积相对小，形状较为整齐，这类细胞为体细胞胚胎的发生做准备，称为胚性细胞（见图1I）。

这些胚性细胞早期分裂形成颜色较深的多细胞原胚，多细胞原胚继续呈纵向、横向分裂。随着体胚不断发育，胚性头部的球体不断膨大，表面变光滑，细胞质密有规则，进而形成明显的孤立化状态的球形胚（见图1J），有的球形胚从愈伤组织中脱落下来。球形胚进一步发育时可见到明显的形成层分布，随着内部组织分化的推进，胚体两端加速生长呈心形的，此时的体胚为心形胚阶段（见图1K～L）。心形胚继续伸长生长发育成鱼雷形胚（见图1M），鱼雷形胚进一步发育成子叶形胚，有些子叶原基在发育过程中，细胞分裂生长不平衡，造成子叶的长短不一（见图1N），但最终形成完整植株。

3 讨论

生理隔离是体细胞胚胎发育的前提条件，如不能形成生理隔离就不能实现体细胞胚细胞的分化和细胞全能性的表达，从而导致体胚中途死亡或畸形。吕秀立等[6]观察表明，七叶树体细胞胚有发育良好的表皮层，特别是成熟胚具备良好的V字型维管束，与愈伤组织间没有微管组织联系，具有生理隔离性。本研究观察到‘小梨枣’体细胞胚发生过程中出现生理隔离现象，胚性愈伤组织中的胚性细胞和非胚性细胞在形态上有较大的差别，随着胚性愈伤组织的不断生长发育，形态与生理上的隔离也逐渐明显，尤在球形胚和心形胚期，在球形胚时期，有的球体己与母体完全脱离。

关于体细胞胚的发生，多数研究认为体细胞胚多发生于胚性愈伤组织表层，如龙眼[7]、鹅掌揪[8]、栾树[9]、香蕉[10]、花生[11-12]、百合[13]、黄榆[14]等，而少数发生于胚性愈伤组织内部的体细胞胚容易中途停止发育形成畸形胚，甚至死亡。王娜[15]认为，生理隔离和营养供应不足可能是造成胚性愈伤组织内部体细胞胚中途死亡或畸形的原因之一。

体细胞胚发生是对合子胚形态发生全过程的重演[16]。不同植物体细胞胚发育经历的阶段不同。香榧体细胞胚的发育经历了原胚、球形胚、棒状胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚6个阶段[17]。攸县油茶胚性细胞团经球形胚、心形胚、子叶形胚发育成了完整植株[18]。云杉体细胞胚发育经过早期原胚、球形胚、早期体胚及子叶胚4个阶段[19]。山杏体细胞胚胎发生过程中可明显看出球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶胚阶段[20]。本试验观察表明，‘小梨枣’体细胞胚发生不同步，经历了原胚、球形期、心形期、鱼雷形胚、子叶形胚5个阶段，与合子胚的发生途径相同。这与郝建平等[4]、程佑发[4]等研究结果一致。

参考文献

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[3]张存智.枣幼胚愈伤组织诱导和胚状体发生[J].北方园艺，2011（13）：125-127.

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[20]何炎红，吴高殷，白玉娥，等.山杏体细胞胚胎发生及其组织学观察[J].经济林研究，2018.36（1）：163-166.