张化雨 徐广平 庞哲 张立荣 马丽霞

摘 要：砂硒因沙子具有透气保水的特性，同时硒释放相对缓慢，能提供稳定的硒来源，是比较理想的富硒蔬果培养基质。为了探讨缓释砂硒对绿甘蓝富硒作用和生长的影响，该研究设置对照组（CK），实验组缓释砂硒（CT）、鸡粪和砂硒1∶1混合（CT1）、鸡粪和砂硒1∶2混合（CT2） 和鸡粪（CT3）5个处理。结果表明：CT、CT1和CT2处理的绿甘蓝硒含量比CK分别增加45%、61%和64%，逐步回归分析表明绿甘蓝硒含量和土壤硒含量呈显著正相关（P<0.05）;CT2处理的效果最好，绿甘蓝的产量增加45%，叶片厚度增加22.78%，水分利用效率提高56.66%。土壤錳含量和硒含量共同解释了绿甘蓝生物量变化的72%，而土壤锌含量解释绿甘蓝水分利用效率变化的66%。这表明砂硒添加后，通过增加土壤硒含量提高绿甘蓝硒含量，砂硒和鸡粪配比更有效地提高了绿甘蓝硒含量并促进其生长。

关键词：缓释砂硒，绿甘蓝，锰和锌，土壤微生物，生物量

Abstract：Natural sand selenium（Se）is a readily available product which is air permeable and watertight. It is a kind of good matrix for producing Se enrichment plant. In order to test the efficiency of sand Se in cultivating green cabbage and provide Se as a nutrition source，we set five groups of experiments：CK （control group without fertilization），CT （natural sand Se），CT1 （chicken manure∶Sand Se=1∶1），CT2 （chicken manure∶sand Se=1∶2），CT3 （chicken manure）. The results showed that sand Se addition significantly increased  Se content of green cabbage by 45%，61% and 64%. Compared with the CK and CT3 groups，the yield，leaf thickness and water use efficiency of the green cabbage in CT2 increased significantly by 45%，22.78% and 56.66%，respectively. Soil manganese and zinc content accounted for 72% variation of the green cabbage biomass and soil zinc accounted for 66% variation of the water use efficiency. These indicate that sand Se，particularly when mixed with chicken manure，not only can provide Se as a nutrition but also is beneficial to green cabbage yield.

Key words：slow-released sand selenium，green cabbage，Mn and Zn，soil microbe，biomass

硒是人体必需的微量元素之一，在维持人体正常生理过程和提高人体免疫力方面发挥着重要的作用 （曾静和罗海吉，2003;姜超强等，2015;梁若玉等，2017;王磊和阳继辉，2017）。人体缺硒会导致多种疾病，如克山病和大骨节病，甚至癌症等（谭见安和朱文郁，1991;郭亚南等，2017）。人体可吸收的硒包括无机硒（硒酸钠和亚硒酸钠）和有机硒。目前发现无机硒强化剂的吸收和利用很不理想，其生物有效性低，毒性较大，更严重的是无机硒中毒量与需要量之间范围小，因而被严格限制其使用量（刘华山，2009;曾庆良等，2018）。利用植物生长过程中吸收无机硒转化为有机硒相对安全（果秀敏等，2003;周鑫斌等，2017）。这一方法目前多用根施硒肥或者叶面喷施无机硒来实现（王宁宁等，1994; 张弛等，2002;刘华山，2009），但这些措施不仅提高了生产成本，而且还存在潜在的环境风险，很难获得硒含量稳定的产品（张联合等，2006;周鑫斌等，2017）。

砂硒具有透气保水特性，同时硒释放相对缓慢，能提供稳定且含量保证的硒，是较理想的富硒蔬果培养基质。但砂硒栽培蔬菜富硒效果如何目前还不十分清楚。绿甘蓝是日常非常普遍的蔬菜，富含维生素C，营养价值高，适合作为日常食补蔬菜。如何用天然富硒基质培育出日常食用且硒含量稳定的富硒蔬菜成为近年来硒产品开发的热点。因此，本研究提出以下问题：（1）砂硒添加是否能提高绿甘蓝硒含量和产量;（2）砂硒添加影响绿甘蓝硒含量和产量的因素是什么。这两个问题的解决能揭示缓释砂硒对绿甘蓝富硒作用和生长的影响，为富硒绿甘蓝的生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样地和实验设计

2017年4月10日在北京市第一○一中学温室内的生态试验田开展实验。在试验田内空旷平坦的种植场地，随机选取5块样地，设置宽50 cm、行距30 cm、长10 m的区域，每块区域随机移栽育好苗的绿甘蓝，间距30 cm。 共5个处理，各3个重复，分别为对照组CK、实验组（CT、CT1、CT2和CT3）。使用砂硒及有机肥鸡粪量见表1。

1.2 材料

土壤：选用北京市第一○一中学生态园内土壤，pH值7.5，硒含量0.14 mg·kg-1。鸡粪肥：生产商为河北高碑店市华舟有机肥制造有限公司，硒含量0.17 mg·kg-1;缓释砂硒：硒含量0.5 mg·kg-1，北京仁创科技有限公司提供，来自于内蒙古奈曼旗的富硒砂，扫描电镜显示其外部（图1：左）及内部（图1：右）具有透气保水的结构（图1）。

1.3 实验过程

1.3.1 催芽 2017年4月20日选取170粒饱满的绿甘蓝种子，并在催芽前进行溫水浸种消毒。待水温降至室温，并等到种子吸水饱满后取出种子，将准备好的培养皿上放上一张厚度适当的纸巾，纸巾打湿并控掉多余的水分，在上面放上消过毒的种子，将其放在培养箱中25～26 ℃进行催芽。在催芽过程中，保持纸巾和芽的湿润，2 d左右观察到芽有白根露出即可。

1.3.2 播种和育苗 2017年4月25日将催过芽的种子播种在小花盆中，当4～5片真叶长出时挑选大小基本相等的幼苗进行移栽。

1.3.3 土壤理化性质测定 每个处理取50 g土样，风干后送到北京市农科院测定土壤理化性质。利用水∶土=1∶5测定土壤pH，利用凯氏定氮法测定土壤全氮含量。用比色法测定土壤速效磷含量。用火焰光度计法测定土壤全钾。根据DTPA（一种螯合剂）浸提法，用原子吸收分光光度计，以乙炔-空气火焰测定浸提液中速效锌、锰、铁的含量。另一部分样品送至中国农科院检测中心测定硒含量，选取环保部发布的硒测定标准，釆用氢化物发生-原子荧光光谱法测定样品中的总硒含量。利用环刀法测定土壤容重和含水量。土壤微生物数量的测定按照《土壤微生物分析方法手册》（许光辉和郑洪元，1986）进行，利用牛肉膏蛋白胨培养基和高氏1号培养基培养土壤细菌和放线菌。具体在7月25日取植株根系附近的土壤，每组分别称取1 g土样，加入9 mL无菌蒸馏水，搅拌均匀后静置15 min，使用移液器取上层清液1 mL进行梯度稀释，分别稀释为10-1～10-7，用血球计数板在显微镜下观察，挑选适合浓度。接种10-2、10-3、10-4进行放线菌的培养观察，接种10-5、10-6、10-7进行细菌的培养观察。稀释后将稀释液分别接种到配好的培养基中，其中细菌培养基包括牛肉膏 3.0 g、蛋白胨 10.0 g、NaCl 5.0 g 、琼脂 15 g、水 1 000 mL，pH 7.4～7.6;放线菌培养基包括KNO3 0.1 g、K2HPO4 0.05 g、MgSO4· 7H2O 0.05 g、NaCl 0.05 g、FeSO4· 7H2O 0.001 g。接种完毕后放入恒温培养箱进行培养，细菌采取30 ℃避光恒温培养，放线菌采取28 ℃避光恒温培养，定期观察培养基上的菌落个数和大小并进行记录。

1.3.4 绿甘蓝指标测定 叶片的测定：在苗期，利用直尺测量绿甘蓝的叶长和叶宽，定期数叶片数并观察叶片颜色;在绿甘蓝移栽成活后，通过直尺测定每片叶子的叶长和叶宽用来计算出叶面积;选取绿甘蓝最大的叶子，利用游标卡尺测量叶片厚度;选择晴朗的天气，在9：00—11：00，光饱和光强下（1 000 μmol·m-2·s-1），用美国Ciras-Ⅲ型便携式光合仪，测定绿甘蓝光合速率（Pn），蒸腾速率（E），气孔导度（Gs），水分利用效率=光合速率（Pn）/蒸腾速率（E）;绿甘蓝叶绿素含量的测定：取绿甘蓝成熟叶，擦净表面的污物，并在叶子上打孔，称量选取的叶子的重量为0.2 g，再用配置好80%的丙酮溶液（分析纯，北京化工厂生产，含量≥99.5°）浸提1～2 d直至叶子变白后开始进行下一步的实验。用80%的丙酮溶液和蒸馏水各洗3遍比色皿后将浸提液倒入其中用UV-1 700c（MC150703001，上海美析仪器有限公司）型紫外可见分光光度计进行测量，在646、663、470 nm分别测量其吸光度，之后根据公式计算叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量，其计算公式分别为Ca=12.21A663-2.81A646;Cb=20.13A646-5.03A663;CT=Ca+Cb=17.32A646-7.18A663;Cx.c=（1 000A470-3.27 Ca-104Cb）/229。

紧实度的测定：绿甘蓝包叶后利用直尺定期测定绿甘蓝包叶直径。生物量测定：在绿甘蓝成熟后，将整株挖起，冲洗干净，将冲洗干净的地上和地下部分用吸水纸吸干，先称鲜重，后在105 ℃下杀青30 min，然后调至65 ℃，烘干至恒重，分别称取地上和地下部分的干重，最后根据称量的数据计算生物量和根冠比。叶片横切面液泡大小和细胞数量的测定：取测过叶片厚度的成熟绿甘蓝叶片，在贴近叶脉右侧距离叶基2 cm处剪宽0.5 cm、长1 cm的叶片放入固定液中（正丁醇：国药集团化学试剂有限公司10005218;无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司100092683;番红固绿（植物）染液：武汉谷歌生物科技有限公司G103;中性树胶国药集团化学试剂有限公司10004160），在中国科学院青藏高原研究所做成石蜡切片。把做好的切片放进组织切片扫描仪（型号：Pannoramic MIDI，厂家：3D HISTECH，匈牙利），仪器自动对焦开始扫描。在10X图片中截取相同面积，数细胞数量，并测量液泡最大和最小直径。每个处理做4个重复，共20个图片。

1.4 数据分析

数据处理及图表绘制运用Excel 2007软件，描述性统计分析运用SPSS18.0软件，采用单因子（One-way ANOVA）进行方差分析，选择Tukey多重比较检验处理对被测定指标的差异，以P<0.05作为差异显著的标准。利用逐步回归的方法，分析测定的土壤理化性质对绿甘蓝硒含量、生物量、蒸腾速率和叶片厚度等的影响。

2 结果与分析

2.1 砂硒对绿甘蓝的影响

从表2可以看出，缓释砂硒各处理导致了部分土壤和植物指标发生显著变化，显著改变了土壤硒含量、微生物菌落数、容重、速效磷、速效铁、速效锰和锌、绿甘蓝硒含量、生物量、叶片厚度、蒸腾速率、水分利用效率和光合色素浓度。

与CK相比，CT、 CT1和CT2分别显著地提高了绿甘蓝叶片硒含量的45%、61%和64%（图2：A）。逐步回归分析显示绿甘蓝硒含量主要是由土壤硒含量决定的（表3）。结果表明添加砂硒，同时添加鸡粪肥更有利于绿甘蓝硒的硒累积，与CK相比，CT2显著增加了绿甘蓝生物量（图2：B）。

与CK相比，CT2显著降低植物叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量（图3：A，B，C）。实验结果表明砂硒或砂硒混合鸡粪肥都不同程度地改变了植物的叶片厚度，其中CT2显著增加叶片厚度的22.78%（图3：D）。从植物的形态指标上看，施鸡粪肥并没有显著改变绿甘蓝的叶面积和叶厚度（P>0.05），但砂硒显著改变了绿甘蓝的叶片厚度。利用逐步回归的方法，未发现所测定的土壤理化性质对甘蓝叶片厚度有直接的影响（P>0.05）。叶片横切扫描结果显示，与CK相比，CT、CT1、CT2和CT3均显著提高绿甘蓝叶片单位面积内液泡大小，但是只有砂硒与鸡粪混合和单独添加鸡粪时绿甘蓝细胞数量才显著增加（表4）。

测定绿甘蓝的蒸腾速率和水分利用效率结果显示，CT2显著降低了绿甘蓝叶片蒸腾速率的34.74%，提高了水分利用效率的56.66%（图3：E，F）。逐步回归分析结果表明土壤锌含量解释了绿甘蓝蒸腾速率变化的66%（表3）。

2.2 砂硒对土壤的影响

与CK相比，施砂硒、施鸡粪混合砂硒1∶1和1∶2分别提高绿甘蓝硒含量的45%、61%和64%（图4：A）。说明砂硒添加起到增加土壤硒含量的作用。与CK相比，砂硒添加不同程度上降低了土壤容重。这是因为砂硒具有保水透气特性，所以砂硒添加降低了土壤紧实度和土壤容重，增加了土壤的孔隙度。实验各处理均对土壤含水量没有显著影响（P>0.05）。

与CK、CT和CT1相比，CT2和CT3均显著提高土壤速效铁、速效磷和锌的含量，CT2与CK相比有效铁含量提高了58.97%、速效磷提高了20.91%，有效锌含量提高了16%。这表明鸡粪添加和砂硒添加都有可能增加土壤有效铁、速效磷和速效锌的含量（图5：A，B，C）。与CK相比，CT2土壤速效锰含量显著增加（图5：D），表明砂硒和鸡粪混合添加是促进土壤速效锰增加的主要原因。相对于CK，CT、CT1、CT2和CT3都提高了土壤微生物的菌落数（图6），其中CT和CT2提高的最多。表明单位面积内砂硒越多土壤微生物菌落数越多，这可能与砂硒比较好的透气保水性有关。

3 讨论与结论

3.1 砂硒对绿甘蓝硒含量和地上生物量的影响

我们的实验结果表明添加砂硒能够提高绿甘蓝硒含量，但同时添加鸡粪肥则更有利于绿甘蓝硒的累积。很多硒酸钠或亚硒酸钠直接添加的实验结果也都表现出无机硒添加提高了植物的硒含量（吴永尧等，1998;刘海燕，2015）。但这些研究也同时发现稍高含量的无机硒添加就会对植物有毒害作用，降低植物生物量，甚至导致植物死亡（吴永尧等，1998;刘海燕，2015）。例如吴永尧等（1998）发现仅仅培养1 d即可见0.5 mg·kg-1硒处理的水稻幼苗叶缘卷曲，1.0 mg·kg-1硒以上的处理则幼苗接近死亡。本研究中，CT（0.52 mg·kg-1硒）、CT1（0.25 mg·kg-1硒）和单纯鸡粪添加均没有影响绿甘蓝的地上生物量，而砂硒和鸡粪混合2∶1却显著升高绿甘蓝生物量。这表明砂硒与鸡粪2∶1能有效提高绿甘蓝的产量。张弛等（2002）发现适量的硒添加油菜根系氧化还原能力和蛋白质含量提高而过氧化物丙二醛的含量降低，显著促进油菜生长发育、维持旺盛的生长活力、增强抗逆性、提高植物硒含量和促进油菜增产。我们的逐步回归分析结果显示土壤硒含量和锰含量解释绿甘蓝生物量变化的72%，这可能是因为锰是植物光合作用必须的元素，硒是植物新陈代谢必须元素，因此硒添加可能通过促进绿甘蓝新陈代谢或者通过提高土壤锰含量从而促进光合作用，间接提高绿甘蓝生物量（Chen et al.，2018）。

人体可摄入的硒包括无机硒（硒酸钠和亚硒酸钠）和有机硒。从2000年开始国际上已禁用无机硒。酵母硒、麦芽硒、纳米硒人体吸收和代谢率低，人体吸收率为40%～60%，且剩余为无机硒残留（王俊等，2003）。目前备受青睐的为天然有机植物活性硒，即从富硒土壤中吸收硒元素的食品，经过生长过程中的光合作用和体内生物转化作用，在體内以硒代氨基酸形态存在，人体吸收率在99%以上，既满足了人体硒元素需要（刘新伟等，2015），又解决了硒的吸收和代谢率偏低难题。因此，真正的富硒食品应是富硒土壤中栽培生产出的有机硒，且通过土壤-植物-（动物）-人的食物链方式补硒是安全有效的途径（王俊等，2003）。

3.2 砂硒对绿甘蓝形态指标的影响

本研究结果显示单纯砂硒添加降低绿甘蓝光合色素含量。这与硒添加对油菜和小麦叶绿素的影响相反。王宁宁等（1994）和张弛等（2002）发现种植小麦添加亚硒酸钠或栽培油菜添加亚硒酸钠均导致植物叶片光合色素含量升高。但刘华山（2009）研究认为不同水平的亚硒酸钠添加对叶绿素降低的影响是暂时的，一般可能最初叶绿素含量略有下降，但是随着生长的继续进行，各处理水平叶绿素含量会趋于同一值。我们的实验结果部分解释了为什么单纯砂硒添加并没有提高绿甘蓝生物量。在我们的实验砂硒混合鸡粪2∶1有助于绿甘蓝叶片厚度增加。普遍认为植物叶片的厚度是由于叶片细胞本身的生长以及植物体内的水分含量引起的。植物水分充足时，植物叶片变厚，缺水时则叶片变薄（陆元洲等，2015）。我们实验结果并没有发现施鸡粪或砂硒影响土壤含水量，也未发现所测定的土壤理化性质对绿甘蓝叶片厚度有直接的影响。叶片横切扫描结果显示砂硒添加显著提高绿甘蓝叶片单位面积内液泡大小，但是只有砂硒配比鸡粪和单独添加鸡粪时绿甘蓝细胞数量才显著增加。因此，本研究绿甘蓝叶片厚度的增加是因为细胞大小和细胞数量增加导致的（Hunder et al.，1981;Lindorf，1994）。

本研究结果表明砂硒混合鸡粪2∶1降低了绿甘蓝蒸腾速率并能有效提高叶片水分利用效率。魏孝荣等 （2005）发现锌添加能显著提高玉米叶片蒸腾速率达36%，而洋甘蓝和花椰菜缺锌都降低了其蒸腾速率（张福锁，1991）。锌在植物气孔开闭中作用机理可能在于碳酸酐酶中含有锌，而碳酸酐酶能够调节CO2的供应（张福锁，1991）。增加锌能够提高植物体内该酶的活性，有利于增加保卫细胞内的HCO-3含量，促进气孔开放。但我们的结果显示CT2土壤锌含量最高却蒸腾速率最低，这表明在水分条件不缺，土壤锌充足时还有其他机制调控着植物的蒸腾速率以此来确保植物有较高的水分利用效率（张福锁，1991）。

总之，缓释砂硒添加（砂硒、鸡粪肥∶砂硒=1∶1，鸡粪肥∶砂硒=1∶2）使绿甘蓝的硒含量分别增加了45%、61%和64%，绿甘蓝硒含量和土壤硒含量显著正相关（P<0.05）;添加缓释砂硒后，降低了土壤容重，增加了土壤微生物菌落数量，提高土壤硒含量，改善土壤理化性质，进而提高绿甘蓝硒含量，尤其砂硒和鸡粪肥配比更有效地提高了绿甘蓝硒含量并促进其生长。这表明砂硒添加不仅提高绿甘蓝硒含量，而且可以改善土壤条件，进一步促进绿甘蓝产量提高，值得在农业上大面积推广。

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