徐重新　刘敏　张霄　刘媛　张存政　刘贤金

摘要：农药残留是威胁农产品质量安全的关键危害因素之一，是农产品质量安全监管工作的重要对象。当前已被开发和投入使用的农药种类纷繁复杂，农药残留检测工作任务多、责任大，因此建立一套可用于农药残留检测用的免疫学快速检测方法一直是广大科研工作者努力探索的目标。本文分门别类梳理农产品中主要农药残留及其危害，探讨国内外抗体创制领域最新热点技术，并就农药残留检测用广谱特异性抗体研发和应用现状进行概述及展望，旨在为指导农药残留快速检测技术的研发提供参考。

关键词：农产品;农药残留;广谱特异性抗体;检测方法

中圖分类号：TS207.5*3

文献标识码：A

文章编号：1000-4440（2019）02-0489-08

农药作为当今世界农业生产不可或缺的重要生产资料，主要用于防控病虫害、杂草及鼠类等，有效保障了农作物的产量和质量，带来了巨大的社会和经济效益”。同时，也因为农药在农业生产过程中的大量使用，其在农产品、水及土壤环境中的残留，给生态环境造成了巨大的负面影响，严重威胁人及动物健康[23]。近年来农药引发的影响较大的农产品质量安全事件也时有发生，如2010年海南“毒豇豆”事件、2013年山东潍坊“毒生姜”事件等，导致多名消费者中毒，影响较大，严重挫伤广大消费者对中国农产品的消费信心[4]。农产品产供过程的用药安全关系到广大老百姓的日常生活，是关乎国计民生的大事，党中央和国务院各有关职能部门高度重视。习总书记2013年在中央农村工作会议上就提出农产品质量安全是“产出来”与“管出来”的重要论断，要求以“四个最严”确保广大老百姓“舌尖上的安全”;2016年12月原国家卫计委、农业部和食药总局联合发布了食品安全国家标准《食品中农药残留最大限量》（GB2763-2016），规定了中国食品中433种农药4140项最大残留限量指标，配套的检测方法接近1000个;与此同时，新修订的《食品质量安全法》和《农药管理条例》已分别在2015年10月1日和2017年6月1日正式颁布实施，《农产品质量安全法》也在着手修订当中[5]。农药残留监测作为农产品准入市场前的最后一道工序，是保障农产品质量安全的最后一道防线。当前农药残留检测分析方法主要分为高精度的仪器分析法[气相色谱法（GC）、液相色谱法（HPLC）、气相/液相色谱串联质谱法（GC/HPLC-MS）]和快速检测法（免疫分析法、酶抑制法、生物传感器法、活体检测法和液体工作站检测法等）[6]。众多方法中，基于“抗原-抗体”结合原理的免疫学检测方法因其具有操作简单、特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大等特点，适用于现场样品分析和大容量样品检测，是农药残留检测的研究热点刀。同时，很多类型的农药都具有通用结构或共性区域等特点[8]，这也为农药检测用广谱特异性抗体提供了依据和可能，本文着重就广谱检测用抗体在农药残留检测上的研究及应用状况进行概述。

1 当前农药使用状况及其主要残留风险

农药作为用于防控农林病虫害及杂草和调节农作物生长的药品的统称，其具有来源广、品种多、成分复杂等特点，是当今农业生产中必不可少的投入品，为农业增产保收做出了巨大贡献[9]。与此同时，随着农业生产对农药的过渡依赖，长期大量使用农药（特别是化学农药）导致农药残留、土壤功能退化、水体和环境污染、生物链结构中断以及生态失衡等一系列问题日益凸显[2.10]。有证据表明，相当一部分化学农药对人畜具有高“三致”（致癌、致畸、致突变）危害风险，越来越引起科学界和政府部门的高度关注[11-12]。按来源可将农药划分为无机农药（砷酸类、氯酸类、硫酸铜等有毒有害无机物）、有机合成农药（有机氯类、有机磷类、拟除虫菊酯类、三嗪类和新烟碱类等合成农药）和生物农药（微生物农药、植物和动物等代谢产物或提取物以及转基因生物毒素）等三大类。本文按类别划分，整理了几种较为典型的代表性农药的主要用途、危害风险及其每日允许摄入量等信息（表1）。

无机农药主要是源于天然的无机类化学物或其制剂，在早期农业生产上发挥了重要作用，然而随着科技的发展，其多数品种因具有毒性强、安全性差、药效欠佳及使用量大等缺点，逐渐被淘汰，其中汞制剂、砷铅类等早已被列入国家禁用农药名录[13]。有机氯农药[如DDT（Dichlo-rodiphenyltrichloroethane）、六六六（Hexachlorocy-clohexane）、艾氏剂（Aldrin）等]主要以苯、环戊二烯以及松节油为原料，结构稳定，不易降解，具有持久性、远距离迁移性、生物蓄积性等特点，能引起人畜慢性中毒，目前有机氯农药已经在世界范围内开始被陆续禁止生产和使用[14]。有机磷农药多数属于磷酸酯类或硫代磷酸酯类化合物，其残留引发的中毒特征主要是导致神经系统机能失调，引发身体不良状况，中国农药食物中毒事件中有机磷农药高居首位，其中甲胺磷（Methami-dophos）、对硫磷（Parathion）、毒死蜱（Chlorpyri-fos）、甲拌磷（Phorate）等已被列入国家禁用农药名录[15-1]。拟除虫菊酯（Pyrethroid）是由天然除虫菊素改变结构后发展而来，是一类类似于天然除虫菊素（Pyrethrin）的有机化学合成物（如高效氯氟氰酯、顺式氯氰菊酯、顺式氰戊菊酯等），因其对作物和多种害虫具有高选择性、高效率、低毒性、快速杀虫和残留少等优点，在现代农业生产中占据了较大市场份额，但菊酯类农药对水生生物具有特异性高毒活性，因而严重威胁水生生物群落平衡[17-18]新烟碱类有机农药也是近年来蓬勃发展的人工合成的超高效杀虫剂[如啶虫眯（Acetamiprid）、噻虫胺（Clothianidin）、吡虫啉（Imidacloprid）、噻虫啉（Thiacloprid）等]，具有广阔的发展前景，对昆虫具有高杀虫活性，而对人及哺乳动物低毒，属于安全农药[19]。生物农药是非化学合成的天然生物源化合物，具有类似农药的作用，主要来源于生物活体或其代谢产物[如当前使用较为成熟的有苏云金芽孢杆菌Bt毒素（Bacillusæthuringiensis，Bt）、2，4-D（2，4-Di-chlorophenoxyacetic acid）、沙蚕毒素（Lumbriconer-is heteropoda）、阿维菌素（Abamectin）等]，一般认为其具有对人畜和非靶标生物安全、环境兼容性好、不易产生抗性、易于保护生物多样性等优点，对人类健康、环境保护和农业的可持续发展都有重大的意义[2[20]，但近年也不断暴露出一些安全隐患，引起关注[21-23]。

2 抗体的发展及其创制技术

抗体（Antibody，Ab）又称为免疫球蛋白（Immu-noglobulin，Ig），是当今生物医药、生命科学基础研究以及免疫学诊断、分析与快速检测等研究领域最热门、使用最广的蛋白质材料[2425]。自1890年德国科学家首次证实在免疫动物的血清里有免疫球蛋白存在，随后抗体结构与功能被不断研究、挖掘和利用，并逐渐发展成为一门全新的热门学科一免疫学（Immunology），到目前为止，抗体制备技术已经从第一代的多克隆抗体（Polyclonal antibody，PAb）制备，第二代的单克隆抗体（Monoclonal antibody，MAb）制备发展到了第三代全新的基因工程抗体（Genetic engineering antibody，GEAb）创制阶段[26]，多克隆抗体是天然抗原经不同途径免疫动物产生的多种抗体的混合物，其制备过程简单，生产成本低，无需特殊的仪器设备，而且亲和力普遍较一般的单克隆抗体高，所以目前仍是抗体制备研究领域最为经典和普及的首选方法;然而其存在抗原结合特异性不强、效价低、数量有限、难以重复制备、不利于批量生产等不可避免的缺陷[27]。目前多克隆抗体主要通过免疫兔、羊、鼠等动物，采集其血清并经纯化（包括饱和硫酸铵盐析、柱亲和层析及吸附法等）获得纯度较高的抗体蛋白[26]。单克隆抗体是Kohler和Milstein在1975年发现并创制的纯单一性抗体，具有抗原特异性和较高亲和力的特点，由此从根本上解决了传统多克隆抗体存在的抗原特异性和可重复性等问题，是抗体制备技术领域标志性的突破，其在生物医药领域的应用价值尤为凸显，现已获批准上市的单抗类药物有近50种，且还有近300种已经进入临床试验阶段[28-29]。目前制备的单克隆抗体以鼠源抗体居多，但单克隆抗体也存在制备周期长、过程繁琐、专业技术要求高、制备条件苛刻以及杂交瘤细胞传代退化等缺点[28]。基因工程抗体兴起于20世纪80年代，是伴随分子生物学、分子免疫学等学科飞速发展而来的一项在分子水平对抗体基因进行剪接修饰及表达与筛选的基因工程人工新型抗体创制技术[30]。Morrison等[31]在1984年首次报道人-鼠嵌合体在骨髓瘤细胞中成功表达，并结合Smith等[32]发明的噬菌体表面展示技术，从而催生出了噬菌体表面展示抗体库技术，由此拉开了人工基因工程抗体创制技术的序幕，抗体就此摆脱动物免疫过程并进入能定向进化成熟的新阶段。目前基因工程抗体类型主要有人源化修饰抗体（如人鼠嵌合抗体）、单链抗体（如剑桥大学蛋白质工程中心推出的Tomlinson I+J库）、单域抗体或纳米抗体（如驼源单域抗体，VHH）和隨机多肽抗体（如NEB公司推出的七肽库、十二肽库）等，此外还有Fab抗体、二硫键稳定抗体、双特异性抗体等衍生抗体3333目前可用于基因工程抗体展示表达的载体主要可以分为噬菌体表面展示系统、核糖体展示系统、酵母展示系统、细菌展示系统、杆状病毒展示系统以及哺乳细胞展示系统等，其中以噬菌体表面展示抗体研究最早技术最成熟、普及最广、应用最成功，也最为人们所关注[3536]。噬菌体抗体是集抗体的表型与基因型于同一个噬菌体上，通过抗原固相筛选，从库中获得抗原特异性抗体的同时也获得其基因，这样极大方便了抗体进一步定向成熟结构分析以及多宿主转移表达和大量制备等3738]。以噬菌体表面抗体展示技术为代表的新型基因工程抗体创制技术，有效避免了免疫及杂交等繁杂过程，使得抗体制备更方便、更省时、更省力，具备自动化高通量筛选和制备特异性抗体的优势，是当今抗体创制研究领域发展最具潜力的技术。

3 广谱特异性抗体创制策略及其在农药残留检测上的应用

农药虽然来源广、成分复杂、结构多样，但针对其残留检测的免疫学检测方法却大同小异，都是依托制备具有识别多种农药成分的广谱特异性抗体，然后建立免疫学检测方法。依据农药共性结构或化学基团制备针对农药广谱检测用的抗体，是当前农药残留检测免疫分析最主要的方式（表2）。针对小分子农药，大多数都是根据其类别的共性结构或化学基团来设计、合成与母体结构密切相关的类似物作为通用性半抗原，然后以半抗原为免疫或包被抗原，制备或筛选广谱特异性抗体[8]。文孟棠等[39]以拟除虫菊酯通用结构间苯氧基苯甲酸（PBA）为半抗原，免疫制备了具有同时识别4种菊酯类农药的单克隆抗体，检测灵敏度在0.24～1.80 mg/L;Zhao等[40]以同样的半抗原为包被抗原，从噬菌体抗体库中成功筛选到具有识别多种菊酯农药的单域抗体，检测灵敏度在0.33～0.86 μg/ml，并建立检测方法用于实际样品添加回收检测。梁颖等[41]和贺江等[42]以甲氧基有机磷类农药通用结构0，0-二甲基硫代磷酸酯（GMP）为半抗原，分别获得了具有同时识别马拉硫磷、稻丰散、乐果、亚胺硫磷等农药的广谱多克隆抗体和人源单链抗体。此外，根据通用半抗原结构，Wang等[43]制备了二乙氧基有机磷类农药广谱多克隆抗体，Eugenia等[4制备了氨基甲酸酯类农药广谱多克隆抗体，王升吉等[45]制备了2，4-D类农药广谱多克隆抗体，Wang等[46]制备了阿维菌素类农药广谱单克隆抗体。大分子农药的残留免疫检测用广谱特异性抗体主要依据其三维结构或者氨基酸序列相似的特点免疫制备或靶向库筛选获得[47]。Dong等[48-49]和Xu等[50]通过三维结构分析，发现BtCry类生物农药Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F等毒素蛋白的DomainI区氨基酸和三维结构具有高度同源性和相似性，并以此为依据通过设计分别成功制备或筛选到了具有识别多种Cry毒素的单克隆抗体和单域抗体，建立的免疫学分析方法可用于实际样品添加回收检测。此外针对特异性农药类别的残留检测，也有采用制备决定簇人工抗原[51]、杂交-杂交瘤抗体[52]以及基因工程抗体的特性改造[53-54]等方式的报道。

4 展望

总的来说，目前广谱特异性抗体在农药残留检测上的应用还处于实验室研究和初步探索阶段，成熟的商品化产品很少，抗体材料和相应的快速检测技术还需进一步加快研究步伐。就抗体材料创制来说，目前传统多克隆抗体、单克隆抗体仍然是农药残留免疫学检测的主流，抗体亲和活力相对稳定、有保障，但从目前发展趋势来看，基因工程抗体在不久的将来必将取代传统多克隆抗体、单克隆抗体用于免疫检测技术研发，不过其前提是基因工程抗体亲和活力定向成熟技术要有实质性的突破，目前定点突变（Site-directed mutagenesis）、易错PCR（Error PCR）、链置换（Chain shuffling）、DNA改组（DNA shuffling）等可用于抗体亲和力改造的技术多数处于理论阶段[65]。就免疫学检测方法来说，目前最为常见的是ELISA法，其基于HRP显色从而间接反映检测物的存在与否，一般对检测物的可分辨灵敏性不高，这样极大限制了抗体的广谱识别能力;为提高既有抗体的检测}灵敏度从而扩大抗体对农药的广谱识别能力，可以大力发展时间分辨荧光免疫分析技术（如抗体标记非放射性稀土离子），如此达到进一步提高抗体对农药的检测灵敏度（可达1000倍以上）的目的[66]

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