李闯 叶劲松 刘昕

摘要：目的  探讨ZBP-89在肝癌组织中的表达与缺氧诱导因子HIF-1α的相关性，为证实ZBP-89通过抑制HIF-1α/Notch1信号通路降低肝癌干细胞“干性”提供依据。方法  选择2016年8月～2018年8月深圳市龙华区人民医院与深圳市人民医院肝胆胰外科120例原发性肝癌患者作为研究对象，收集病理标本，采用免疫组化染色方法来检测肝癌细胞及癌旁组织中ZBP-89、HIF-1α的相关表达，分析二者之间的相关性。结果  ZBP-89在肝癌组织中呈现出低表达状态，而在癌旁组织中却呈现出高表达状态，分别为34.17%、62.50%;ZBP-89在癌旁组织中表达高于肝癌组织（P<0.05）。而在肝癌组织细胞中发现ZBP-89的表达与缺氧信号因子HIF-1α的表达呈负相关（P<0.05）。结论  ZBP-89很可能为肝癌发生、发展过程中一个潜在的抑癌基因，通过抑制HIF-1α/Notch1通路进而抑制肝癌干细胞增殖、增强肝癌干细胞对化疗药物的敏感性，可能是其发挥抑癌效应的重要机制。

关键词：肝癌;ZBP-89;HIF-1α;缺氧调控因子

中图分类号：R735.7                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.15.023

文章编号：1006-1959（2019）15-0074-03

Abstract：Objective  To investigate the correlation between the expression of ZBP-89 in hepatocarcinoma and the hypoxia-inducible factor HIF-1α， and to provide evidence for ZBP-89 to reduce the "dryness" of liver cancer stem cells by inhibiting HIF-1α/Notch1 signaling pathway.Methods  From August 2016 to August 2018， 120 patients with primary liver cancer in the Department of Hepatobiliary Surgery of Shenzhen Longhua District People's Hospital and Shenzhen People's Hospital were selected as subjects. Pathological specimens were collected and immunohistochemical staining was used to detect liver cancer cells. The correlation expressions of ZBP-89 and HIF-1α in adjacent tissues were analyzed， and the correlation between them was analyzed. Results  ZBP-89 showed low expression status in liver cancer tissues， but high expression status （41/120， 75/120） in adjacent tissues 34.17%， 62.50%， respectively; ZBP-89 in adjacent tissues the expression was higher than that of liver cancer tissues （P<0.05）. The expression of ZBP-89 was negatively correlated with the expression of hypoxia signal factor HIF-1α in hepatocarcinoma cells （P<0.05）.Conclusion  ZBP-89 is likely to be a potential tumor suppressor gene in the development and progression of hepatocarcinoma. It can inhibit the proliferation of hepatocellular carcinoma stem cells and enhance the sensitivity of liver cancer stem cells to chemotherapeutic drugs by inhibiting HIF-1α/Notch1 pathway. An important mechanism of effect.

Key words：Liver cancer;ZBP-89;HIF-1α;Hypoxia regulator

ZBP-89（zinc-finger binding protein-89）是1996年由Merchant等首先發现，是Krüppel-type（Cys2-His2-type）锌指蛋白家族成员之一。因其N端含有四个锌指结构域和分子量大小为89 kD，所以命名为ZBP-89[1]。ZBP-89是一个具有双向调节功能的转录因子，通过结合富含GC的DNA序列激活或抑制基因表达[2]。目前发现受其上调的靶基因有p21、Bak、MMP3、pdcd4、IAP、stromelysin、GHR等，受其下调的靶基因有gastrin、ENA-78、SOX18、Pax7等[3]。ZBP-89可以通过直接结合来稳定p53的表达，通过促进p53在核内的滞留而提高其转录活性，引起细胞周期阻滞和凋亡[4]。目前关于ZBP-89的表达调控的研究显示HIF-1a在细胞水平上可以上调ZBP-89的表达，并且ZBP-89启动子上有潜在的HIF-1a仅结合位点，但两者在肝癌组织中的相关性未见报道，本研究通过实验数据论证ZBP-89在肝癌及癌旁组织中的表达阳性率，分析转录蛋白ZBP-89与肝癌组织细胞的相关性及肝癌组织中ZBP-89对于肝癌细胞增殖凋亡的影响，通过实验镜下观察收集数据说明ZBP-89与缺氧信号调控因子HIF-1α蛋白的相关性，进一步论证ZBP-89通过抑制缺氧信号因子HIF-1α的转录来抑制肝癌细胞的增殖生长，现报道如下。

1材料和方法

1.1材料  本阶段实验研究总共收集深圳市龙华区人民医院普通外科和深圳市人民醫院肝胆胰外科2016年8月～2018年8月原发性肝癌手术后石蜡固定病理标本共120组，其中男性91例，女性29例，所有肝癌患者均未接受过术前新辅助放化疗及生物治疗。每组包括：①肿瘤组织：在肝癌手术标本中心留取肝癌组织;②癌旁组织：均取自距离肿瘤边缘2 cm以上正常肝组织。

1.2试剂与仪器  选用兔抗人ZBP-89多克隆抗体和鼠抗人HIF-1α单克隆抗体均由Santa Cruz公司提供，免疫试剂盒SP-9001由北京中衫金桥技术公司生产提供;Nikon TE2000-U显微镜。

1.3方法  免疫组化染色：先行将2种石蜡病理标本切片脱蜡，用磷酸盐缓冲液冲洗15 min，反复冲洗3次。然后将切片放于pH 9.0的缓冲液中修复，在微波中修复20 min（95℃），冷却30 min后，再次缓冲液冲洗3次，再加入山羊血清进行封闭，至于温箱（37℃）放置1 h，然后滴加一抗（1∶200稀释兔抗ZBP-89多克隆抗体），放入冰箱静置12 h，复温后用缓冲液冲洗3次，滴加生物素二抗（1∶100稀释鼠抗人HIF-1α单克隆抗体），置于37℃温箱15 min，再次用缓冲液冲洗3次;然后滴加DA染色液显色，用水中止反应，苏木素复染、脱水、封片，镜下观察结果。

1.4观察指标  免疫组化染色后，镜下观察120组病理标本中肝癌组织及癌旁组织中转录蛋白ZBP-89的表达阳性结果、肝癌组织细胞中ZBP-89与HIF-1α的表达阳性结果。ZBP-89和HIF-1α的表达阳性评分标记参考已发表的文献[5，6]。

1.5统计学方法  使用SPSS 15.0进行统计学分析，计数资料均以？字2检验表示，使用Pearson相关系数判断相关性;实验数据非正态分布资料使用Mann-Whitney检验，判断相关性用Spesarn等级相关及Spesan秩相关检验，使用Spearman等级相关及秩相关检验判断相关性。检验水准α=0.05，P<0.05差异有统计学意义。

2结果

2.1 ZBP-89在肝癌组织及癌旁组织中的表达  ZBP-89在肝癌组织中呈现出低表达状态，阳性表达主要位于肝癌细胞细胞核及胞浆;而在癌旁组织中却呈现出高表达状态，分别为34.17%（41/120）、62.50%（75/120）; ZBP-89在癌旁组织中表达高于肝癌组织（P<0.05）（图1）。HIF-1α在肝癌组织中呈现高表达状态（P<0.05）（图2）。

2.2 ZBP-89与缺氧信号调控因子HIF-1α的相关性分析  在总肝癌病理标本中ZBP-89与缺氧信号调控因子HIF-1α蛋白的表达呈现负相关性（？字2=9.606， P=0.002），见表1。

3讨论

实体瘤微环境通常存在缺氧，缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）居于核心调控位置[7]。HIF-1由α亚基和β亚基组成，其中α亚基受细胞内氧气浓度精密调控，对HIF-1功能的发挥起关键作用;在常氧条件下α亚基极易被脯氨酸羟化酶（PHD）羟基化，然后与pVHL 蛋白靶向结合，最后经泛素化蛋白酶途径而被降解;在正常氧状态下，HIF-1α的半衰期<5 min。而缺氧条件时α亚基的羟基化作用被完全抑制，致使α亚基和β亚基发生异二聚化并转运进入细胞核，然后通过招募转录共激活因子p300/CBP，与靶基因的启动子上的缺氧反应元件（hypoxia response elements，HREs）相结合，调控多种缺氧反应基因[8]。前期研究发现，Notch1基因启动子上含有多个HRE，HIF-1α过表达可增加肝癌细胞Notch1、EpCAM、CD13蛋白的表达，提示Notch1可能为HIF-1α下游靶基因。因此，在缺氧微环境中HIF-1α/Notch1通路对肝癌干细胞“干性”的维持起重要作用。

研究发现[9]，ZBP-89在肿瘤组织中普遍存在表达异常，但同肿瘤的关系尚不清楚，且主要集中在ZBP-89的转录调控功能上。基于本课题组前期研究结果，再结合ZBP-89可协同或促进p53、p21、pdcd4蛋白引起肿瘤细胞产生凋亡的相关文献报道，推测ZBP-89很可能为肝癌发生、发展过程中一个潜在的抑癌基因。抑制HIF-1α/Notch1信号通路进而抑制肝癌干细胞增殖、增强肝癌干细胞对化疗药物的敏感性，可能是其发挥抑癌效应的重要机制。对HIF-1α的启动子的分析发现，HIF-1α的启动子上均存在多个Sp1的可能结合位点，文献亦报道Sp1可同HIF-1α的启动子结合影响其表达。因ZBP-89常可竞争结合基因启动子上Sp1的结合位点，所以我们推测ZBP-89同HIF-1α启动子上的Sp1结合位点结合进而抑制HIF-1α的转录可能是其抑制HIF-1α表达的主要机制之一。

本研究通过免疫组化方法对ZBP-89在肝癌组织细胞中及癌旁细胞重的蛋白质表达进行检测，发现ZBP-89在62.50%的肝癌旁组织细胞中呈现高表达状态，在34.16%的肝癌组织细胞中呈现高表达状态，由此可见ZBP-89在肝癌组织中的表达明显低于其在癌旁组织中的表达。查阅相关文献显示[11]：肝癌组织中的ZBP-89的过度表达可能诱导肝癌细胞的凋亡，进而抑制肝癌细胞的生长。而相关研究发现，HIF-1α在细胞水平上可以上调ZBP-89的表达。本研究在组织学上进一步验证了HIF-1α和ZBP-89的关系，二者在肝癌组织细胞中呈现负相关性。

由此可见，以HIF-1α/Notch1通路为肿瘤治疗的靶点，可更有效地消除肝癌干细胞，提高肝癌的治疗效果。ZBP-89表达上调后肝癌干细胞标记物EpCAM、CD13的表达减少，HIF-1α和Notch1的表达也显著降低，因此，我们推测ZBP-89很可能为肝癌发生、发展过程中一个潜在的抑癌基因。通过抑制HIF-1α/Notch1通路进而抑制肝癌干细胞增殖、增强肝癌干细胞对化疗药物的敏感性，可能是其发挥抑癌效应的重要机制。该研究有利于进一步揭示ZBP-89的生物学功能，增强其对肝癌预后判断的准确性，有望为肝癌治疗提供新的思路。

参考文献：

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[2]Xiao YF，Yong X，Tang B，et al.Notch and Wnt signaling pathway in cancer：Crucial role and potential therapeutic targets[J].Int J Oncol，2016，48（2）：437-449.

[3]Wang R，Sun Q，Wang P，et al.Notch and Wnt/β-catenin signaling pathway play important roles in activating liver cancer stem cells[J].Oncotarget，2015，7（5）：5754-5768.

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[6]Cai MY，Imo RZ，Li YH，et al.High-expression of ZBP-89 correlates with distal metastasis and poor prognosis of patients in clear cell renal cell carcinoma[J].Biochem Biophys Res commun，2012，426（4）：636-642.

[7]Thienpont B，Steinbacher J，Zhao H，et al.Tumour hypoxia causes DNA hypermethylation by reducing TET activity[J].Nature，2016，17，537（7618）：63-68.

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[9]Chen YL，Chen PM，Lin PY，et al.ABCG2 Overexpression Confers Poor Outcomes in Hepatocellular Carcinoma of Elderly Patients[J].Anticancer Res，2016，36（6）：2983-2988.

[10]Semenza GL.Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine[J].Cell，2012，148（3）：399-408.

收稿日期：2019-7-5;修回日期：2019-7-15

編辑/肖婷婷