Hasan Nihal　郭世辉　杨洪一

摘要以大鼠粪便样品为试材，经多次分离培养，获得了8个特异菌落，其直径为1～2mm，革兰氏染色阴性。以分离菌株的基因组DNA为模板，利用细菌16SrRNA通用引物对菌株进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序。结果表明，测序结果与Gen Bank中已报道的奇异变形杆茵（Proteus mirabikis）菌株的序列相似性为100%;结合形态学特征，初步鉴定菌株32N、36N、20A为奇异变形杆菌。奇异变形杆菌为条件致病菌，应注意避免动物粪便对水及食物的污染。

关键词 奇异变形杆菌;PCR;测序;大鼠粪便

中图分类号 R446.5

文献标识码 A

文章编号 1007-5739（2019）05-0196-01

变形杆菌（Proteus）广泛分布于水、土壤腐败的有机物以及人和动物的肠道中，为条件致病菌，多为继发感染，如慢性中耳炎、创伤感染等，也可引起婴儿腹泻、食物中毒等”。变形杆菌属包括普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）、莫根变形杆菌（Proteus morganii）等。奇异变形杆菌广泛分布于自然界、人和动物体表及肠道中，在人或动物体内或体表的适宜环境中生长并大量繁殖时，可诱发泌尿系统炎症、中耳炎、菌血症及小儿急性、慢性腹泻等多种疾病。

奇异变形杆菌可污染动物性食品，特别是肉类，是引起食物中毒的重要因素叫。因此，对其进行鉴定极为重要。本研究自大鼠粪便中分离出了3株细菌，并经鉴定其为奇异变形杆菌。

1材料与方法

1.1细菌分离

取约1g大鼠粪便样品，加入10mL生理盐水，搅拌，使粪便分散到溶液中，并对溶液进行10～100倍稀释。取100μL稀释液，接种到哥伦比亚血琼脂培养基上。在37C厌氧箱中培养24～48h。对培养出的菌落进行多次纯化，之后将纯化的菌株保存于-80C条件下。

1.2镜检及染色

挑取单个菌落镜检，观察菌体的形态特征，并进行革兰氏染色。具体操作如下：①取洁净的载玻片并进行消毒，滴加10μLPBS缓冲液。②用接种环挑取单个菌落与PBS缓冲液充分混匀，然后利用火焰固定菌体。③滴加结晶紫染色液，1min后冲洗。④滴加碘液媒染，1min后水洗。⑤滴加95%乙醇脱色，30s后水洗。⑥滴加沙黄复染，30s水洗。⑦吸千多余水分，自然風干，镜检，观察细菌形态。

1.3细菌总DNA提取

取1.5mL无菌离心管，加入200μL菌液，在12000r/min转速下离心1min，弃上清液;加入50μL灭菌水，充分混匀。利用Invitrogen基因组DNA分离试剂盒进行细菌总DNA提取。

1.4PCR反应

以提取的基因组DNA为模板，利用细菌通用引物27F（5-AGAGTYTGATCCTGGCTCAG-3）、1492R（5'-GGTTACCTI'GTI'ACGACTT-3）进行PCR反应。

PCR反应的条件为：94C、5min预变性;94C、60s变性，58C、60s退火，72C、120s延伸，31个循环;最终72C延伸反应8min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将电泳片段切胶、纯化回收并检测回收片段的质量和浓度，由吉林省库美生物科技有限公司进行测序。对测序结果进行BLAST分析（http：//blat.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），并且利用软件ClusterW进行多序列比对，生成系统进化树。2结果与分析

粪便样品经多次分离培养，获得了8个特异菌落，其直径为1～2mm，表面光滑、湿润，边缘整齐。菌株革兰氏染色呈红色，为杆菌。

以分离菌株的基因组DNA为PCR模板，利用细菌16SrRNA通用引物对菌株进行PCR扩增。所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示目的条带大小约为1500bp，与预期相符。对3个菌株的特异性PCR产物进行了测序，结果显示菌株32N、20A的测序结果与GenBank中已报道的奇异变形杆菌菌株ALK044的序列相似性为100%，菌株36N的测序结果与GenBank中已报道的奇异变形杆菌菌株WWi82的序列相似性为100%。系统进化分析显示，本研究中的3个菌株（36N、32N、20A）与奇异变形杆菌菌株WWi82、ALK044聚集在一个进化枝上（图1）。结合形态学特征，初步鉴定菌株32N、36N、20A为奇异变形杆菌。

3结论与讨论

动物肠道是一个营养丰富的微环境，适于微生物生存。在人体中，肠道细菌数量高达百万亿，推测有500～1000种微生物，总重量达1.5kg，基因数达500万4。在鼠肠道中，肠道菌群可分为3类5：共生菌，主要有拟杆菌、梭菌、双歧杆菌、乳酸杆菌等，该类菌群数量庞大，是肠道菌群中的主体，可调节宿主代谢，并保护肠道;条件致病菌，主要包括肠杆菌、肠球菌等，尽管该类菌种较少，当宿主菌群代谢失调或免疫力～下降时，该类菌群可引发多种肠道疾病，且治疗较困难致病菌，如沙门氏菌致病大肠杆菌等，此类菌群类别较多样，通过食物或呼吸道进人肠道后，可引发疾病，是腹泻及食物中毒的主要病因。

奇异变形杆菌作为肠道中条件致病菌中的重要类群，对人类健康具有一定的潜在危害。本研究在大鼠粪便中分离出了奇异变形杆菌，目前也有较多在人及其他动物粪便中分离出该菌的报道。因此，需要关注奇异变形杆菌在自然环境中的分布，并注意避免动物粪便对水及食物的污染问。此外，要加大对食品中奇异变形杆菌的检测，控制其经食物进人人体并引发疾病。

传统奇异变形杆菌的检测主要基于生理生化反应进行鉴定"”。本研究基于细菌核糖体16SrRNA测序并结合形态学特点对奇异变形杆菌进行了检测，试验流程较长，但灵敏度、准确性皆较高。

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