刘铭扬　冯敏铃　邹学仁　张定煌　张益文

摘要建立了超高效液相色谱（UPLC）测定火龙果中多菌灵（MBC）残留的快速分析方法，即火龙果样品经乙腈提取，NH2小柱净化，紫外检测器测定，外标法定量。通过比较QuEChERS、NH2和MCX固相萃取柱净化效果，对样品前处理和色谱分离条件进行优化，确定火龙果中多菌灵的检测方法。结果表明，检出限（SIN=3）为0.004mg/kg，方法定量限（S/N=10）为0.013mg/kg，多菌灵含量在0.02～1.00μg/mL之间呈良好的线性关系，相关系数为0.9998。添加量为0.02～0.20mg/kg时，平均回收率在80.6%～85.5%之间。该方法具有操作简单、灵敏度高和重现性好等特点，适合火龙果中多菌灵检测分析。

关键词 火龙果;多茵灵;超高效液相色谱;紫外检测器;NH2小柱

中图分类号 S667;S481*.8

文献标识码 A

文章编号 1007-5739（2019）05-0107-02

火龙果味道香甜，且具有很高的营养价值，集“水果”“花卉”“保健”“医用”为一体，被称为神仙果。火龙果的果实除可直接食用外，还可以进行深加工，如火龙果酒、火龙果花醋、火龙果食用色素、火龙果水果罐头等1-21。由于中山市气候适合火龙果种植且能获得较好的经济效益，所以中山市家庭农场都有大面积种植火龙果。火龙果容易受病菌感染，需要对果园土壤杀菌消毒，而多菌灵是火龙果生产中使用的主要除菌农药。因此，多菌灵农药残留也是当前火龙果种植中存在的主要问题之一。

食品安全一直是欧美发达国家重视的问题，尤其对农残、兽残和重金属等要求日趋严格。多菌灵又名苯并咪唑44号、棉萎灵，化学名N一（2-苯并咪唑基）一氨基甲酸甲酯，是一种低毒高效、广谱抗植物真菌药，广泛应用于水果中病菌感染的防治3-7。当地农民常用多菌灵预防火龙果炭疽病，很多大型农贸批发市场和农检站的农残快速试剂盒不能检测水果中的多菌灵。当前使用LC/MS检测多菌灵具有灵敏度高、定性和定量准等优势，但是LC/MS价格昂贵，尚未在基层农检站普及使用，所以使用超高效液相色谱仪检测多菌灵仍是当前最有效的方法之一。本方法通过优化样品前处理过程、选择合适的固相萃取小柱净化，以达到回收率高、灵敏度高的要求。采用UPLC检测，流动相为甲醇+水（体积比为30：70），色谱柱为AgilentEC-C18（4.6x150mm，2.7μm），多菌灵保留时间为2.597min，出峰时间快，能快速检测，满足大批量水果样品检测多菌灵的需求。

1材料与方法

1.1材料及试剂

试验所用火龙果均购于中山市附近家庭農场。

供试药剂：多菌灵（DR）;乙腈、甲醇、二氯甲烷（色谱级）;盐酸、无水硫酸钠、无水氯化钠、氨水（GR）。

1.2仪器与设备

超高效液相色谱仪（Waters Acquity）;电子天平（METTL ER TOLEDO）;振荡摇床（IKAKS501）;旋涡混合器（IKAVO-RTEX2）;水浴氮吹仪（Biotage5 T250）;冷冻离心机（ThermoST40）;超纯水机（ELGA CLXXXUVM2）;加速溶剂萃取ASE（DIONEX ASE100）;固相萃取柱：NH2小柱（Agilent500mg，6mL，12256045）;QuEChERS（Dispersive SPE，5982-5056）;MCX小柱（Waters150mg，6mL，186000256）。

1.3试验方法

13.1样品前处理。将火龙果去除叶冠部分，切碎混合均匀，按四分法缩分，置于食品搅拌机中打浆，取500g用塑料样品瓶-18C密封保存。准确称取火龙果样品10g（精确至0.01g）于50mL康宁离心管中，加入5g无水氯化钠和无水硫酸钠，加入一个陶瓷均质子（防止样品结块），再加入20mL乙腈，盖上离心管盖子，超声提取5min后，放人摇床圆周振荡30min后取出。放人离心机，以8000r/min的转速离心4min，使乙腈与饱和食盐水分层。吸取5mL上清液于试管中，放入40C氮吹仪吹干，待用。加入2mL甲醇+二氯甲烷（体积比5：95）吹至近干的试管中，漩涡1min。用5mL甲醇+二氯甲烷（体积比5：95）预淋洗NH2小柱，当溶剂液面到达柱子填料表面时，关闭固相萃取装置开关，弃去预洗液，保证小柱不断流，迅速加入2mL残渣溶解液，再用3mL甲醇+二氯甲烷（体积比5：95）旋涡提取残渣，重复1次，挤干，收集。40C水浴氮吹仪吹至近干后，用1mL甲醇定容，经0.22um有机相滤膜过滤于样品瓶中，待测。

1.3.2标准工作液配制。称量（精确至0.01mg）多菌灵标准品，用甲醇定容，配制浓度为1000μg/mL多菌灵标准储备液，-18C棕色样品瓶保存，有效期为1年。标准工作溶液配制，通过逐级稀释，配制1μg/mL工作液，最后用基质稀释，配制多菌灵浓度分别为0.02、0.05.0.10、0.20、0.50、1.00μg/mL。1.3.3仪器条件。色谱柱为AgilentEC-C18（4.6x150mm，2.7μm）;流动相为甲醇：水（V/V）=30：70;流速为0.4mL/min;检测器为TUV;检测波长为286nm;进样量为10μL;柱温为30C。

2结果与分析

2.1流动相选择

分别试验了甲醇+水（体积比30：70）、甲醇+水（体积比40：60）、乙腈+水（体积比30：70）、乙腈+水（体积比40：60）作为流动相对多菌灵的分离效果结果表明，上述几种不同配比的流动相都能有效从火龙果基质中分离出多菌灵，但综合试验对环境因素和人的影响，选择毒性相对较小、价格便宜且配制过程更简单的甲醇+水（体积比30：70）作为流动相。多菌灵在火龙果基质中的超高效液相色谱见图1。

2.2提取溶剂的选择

根据相似相容原则，本试验选择乙腈、乙醚和乙酸乙酯作为农药提取剂进行比较。结果表明，乙腈提取的颜色最浅，且回收率最高，而且，乙腈是实验室常用试剂，所以本试验最终选择回收率最好、提取杂质更少的乙腈为提取溶剂。

2.3固相萃取小柱的选择

试验分别对比了MCX和NH2小柱的净化效果和回收率，通过加标回收试验将NH2与MCX小柱进行对比，同时每种小柱做3个添加浓度（0.02、0.04、0.20mg/kg），共6个平行试验，综合价格、平均回收率净化效果等因素选择净化柱。其中，NH2小柱净化方法做了3个配比淋洗液，即甲醇+二氯甲烷（体积比1：99）、甲醇+二氯甲烷（体积比5：95）、甲醇+二氯甲烷（体积比10：90）作为比较，选择净化效果最好、回收率最高的淋洗液。

MCX小柱：加入0.1mol/L盐酸5mL于吹干的试管中，漩涡溶解残渣1min后，分别加人5mL甲醇和5mL水预淋洗MCX小柱，加入0.1mol/L盐酸1mL先使其酸化，保证待测物保留在MCX小柱填料中，迅速加入5mL残渣溶解液，再用5mL水、5mL甲醇淋洗，不收集，关闭固相萃取装置开关，弃去废液，净化过程中保证小柱不断流。向固相萃取装置中加入试管收集，用3mL5%氨水一甲醇溶液淋洗小柱，重复1次，洗耳球吹干，收集并在40C氮吹仪吹至近干后，用1mL甲醇定容，过0.22μm有机相滤膜于样品瓶中，待测。

结果表明，使用甲醇+二氯甲烷（体积比1：99）淋洗NH2小柱平均回收率接近55%;使用甲醇+二氯甲烷（体积比5：95）淋洗NH2小柱平均回收率接近85%;使用甲醇+二氯甲烷（体积比10：90）淋洗NH2小柱平均回收率接近80%，但杂质多，会影响目标峰;MCX小柱平均回收率则接近90%。最终综合考虑价格、净化效果、回收率，选择了甲醇+二氯甲烷（体积比5：95）淋洗NH2小柱为前处理净化方法。

2.4QuEChERS与固相萃取小柱净化的比较

QuEChERS是未来检测发展的趋势，现主要用于水果中农药快速提取和净化色素等杂质1812。对比试验如下：准确称取火龙果样品10g（精确至0.01g）于50mL离心管中，依次加入5g无水氯化钠.5g无水硫酸钠、20mL乙腈，放入陶瓷均质子（防止样品结块），振荡摇床上振摇30min取出，以8000r/min转速离心4min。取出乙腈上层提取液15mL于DispersiveSPE管中，以5000r/min转速离心5min，吸取上清液5mL，吹干定容1mL，过0.22μm有机相滤膜于样品中，待测。

试验结果表明，经QuEChERS方法前处理后，用超高效液相色谱分析，干扰物质较多，样品中基质峰干扰较大，容易出现假阳性峰，不能准确地定性、定量。QuEChERS方法虽然前处理简单，净化后多用于质谱分析，但由于质谱普遍价格昂贵维护成本高、操作难度大等尚未在基层普及。因此，本试验选用超高效液相色谱法测定，经固相萃取小柱净化，能够很好地适用于超高效液相色谱上机分析。

2.5基质效应

基质干扰组分对分析物的浓度和质量测定精确度起到干扰作用，称为基质效应。基质不同，基质效应也存在很大的差异。因此，为了能去除基质效应，采用相同空白基质配制工作曲线进行定量，降低基质效应，增加定量的准确性，减少假阳性误判。

2.6方法标准曲线、相关系数、检出限及定量限

经检测分析，用不含目标物的火龙果按照1.3.1方法净化后，作为空白基质，将多菌灵储备液按照1.3.2进行配制，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。求得线性方程y=79.34064x-1025.877，相关系数为0.9998。按本试验方法测定的结果，以3倍信噪比作为方法检出限（S/N=3）为0.004mg/kg，10倍信噪比作为定量限（S/N=10）为0.013mg/kg。

2.7方法的精密度和准确度

方法回收率是通过加标回收试验实际值与理论值的比值计算，以不含多菌灵的火龙果添加3种不同浓度多菌灵标准品做加标回收试验，每个添加浓度做6个平行试验，同时做2个空白试验。平均回收率在80.6%～85.5%之间，相对标准偏差在5.3%～7.2%之间（表1）。说明该试验方法具有较高的回收率和较好的精密度，可以作为检测火龙果中多菌灵的方法使用。

2.8实际样品分析

选择若干中山市家庭农场，共采集30个火龙果样品，按照本方法的仪器条件对火龙果样品进行分析。有5个火龙果样品检出多菌灵，但5个样品的检测结果均低于定量限0.02mg/kg，略高于检出限0.004mg/kg。

3结论与讨论

本文通过筛选提取剂、优化样品净化等前处理方法，建立了超高效液相色谱法分析火龙果中多菌灵农药残留。本方法采用超高效液相色谱法测定火龙果中的多菌灵，前处理采用乙腈提取、NH2小柱净化，能有效地减少基质干扰，灵敏度和精密度较高，适用于实际样品检测，能满足火龙果样品中多菌灵残留快速筛查和批量检测的工作需求。

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