于涵 王晓萍 吴姝菊

摘要：拟研究常规施肥下纳米硅藻页岩的施用对水稻土壤中微生物群落功能多样性的影响，为合理施用纳米硅藻页岩改良农田土壤微生态环境提供理论参考。以常规水田土壤为研究对象，分别施用0、150、300、600 kg/hm2等4种不同剂量的纳米硅藻页岩（分别记作CK、DS150、DS300、DS600），采用Biolog技术进行研究。结果表明，与对照处理相比，DS300处理可以提高土壤微生物活性、微生物群落物种多样性、微生物对碳水化合物类碳源的利用率。对31种碳源作主成分降维分析表明，DS300处理的土壤微生物能够提高对D-半乳糖醛酸、D-甘露醇、N-乙酰-D-葡萄糖胺等共13种碳源的利用率。此外研究表明，施用300 kg/hm2纳米硅藻页岩可以提高土壤微生物的代谢活性和微生物对碳源的利用能力，从而增强水稻土壤微生物的功能多样性，促进微生物类群向更好的趋势发展，对于维持农田土壤生态系统的健康有重要意义。

关键词：纳米硅藻页岩;微生物群落;功能多样性;Biolog法;主成分分析;碳源利用

中图分类号： S154.3  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）05-0217-05

收稿日期：2018-09-21

基金项目：黑龙江省高教强省专项“互联网+农业”（编号：黑农委联发2016-64）。

作者简介：于 涵（1994—），女，山东日照人，硕士研究生，主要从事分子遗传学研究。E-mail：yuhan18045884692@126.com。

通信作者：吴姝菊，硕士，教授，主要从事植物栽培养护与植物生态修复方向的研究。E-mail：shuju1965@163.com。

纳米硅藻页岩是一种具有巨大表面积和丰富毛孔状微孔隙且富含二氧化硅的天然纳米矿物[1]，具有很强的吸附能力，起源于黑龙江省嫩江流域，其储量丰富，开采方便，对于保持和提高土壤肥力及农业可持续发展均有重要作用[2]。过去对纳米硅藻页岩的研究主要集中在工业领域，忽视了纳米硅藻页岩在农业领域的开发和利用。近年来，有许多学者研究认为，纳米硅藻页岩在土壤改良和修复方面有许多优良特性[3]，对微生物的吸附能力较强，可以改变微生物的活性和数量[4]。有研究表明，施用纳米硅藻页岩可以调节土壤的理化性质，并降低有毒有害元素对植物的毒性[1，5]。还有研究表明，纳米硅藻页岩对土壤养分元素的缓释和利用[6]、对土壤酸碱度的调节[7]、对微生物的物理保护作用以及对有毒有害物质的吸附等都有利于提高土壤微生物的活性及数量[4]。此外，有研究表明，纳米硅藻页岩同类物质的施用能够提高土壤微生物群落的功能多样性[8]，施用纳米硅藻页岩能够促进细菌的生长，增加细菌数量[4]，提高酶活性[7]。近年来，随着可再生能源的逐渐减少，纳米硅藻页岩在农田土壤上的应用正逐渐受到研究者们的关注。

土壤中微生物的数量庞大，代谢能力较强，是土壤生态系统的重要组成部分，微生物的功能多样性对土壤变化非常敏感，不仅是衡量土壤质量变化的灵敏指标，同时也是评价生态系统是否可持续的重要生物学指标[9]。因此，研究土壤微生物的功能多样性具有重要意义。

研究土壤微生物群落多样性的方法很多，Biolog微孔平板法能够简单、快速地定量分析微生物群落对碳源利用的动力学特征[10-11]，因此倍受研究者们喜爱。目前，已有研究表明，纳米硅藻页岩对水稻土壤有显著的改良效果[5]，目前施用纳米硅藻页岩对农田土壤微生物影响的研究尚未见相关报道，缺乏纳米硅藻页岩直接施用后对土壤生态系统中微生物代谢情况的系统研究。因此，本研究采用Biolog微孔板技术，以常规水稻生产田为研究对象，研究不同施用量的纳米硅藻页岩处理对土壤微生物群落碳源利用及代谢能力的影响，以期阐明施用纳米硅藻页岩后水稻土壤微生物多样性的变化规律，为纳米硅藻页岩在改良农田土壤微生态环境方面的作用提供理论依据。

1 材料与方法

研究地区位于黑龙江省哈尔滨市道外区农技示范中心（地理位置为126°56′E，45°56′N），海拔119 m，属于中温带大陆性季风气候区，年均气温为3.50～4.50 ℃，全年无霜期为135～145 d，年均降水量为400～600 mm，降水多集中于6—9月[12]。

1.1 试验材料

纳米硅藻页岩粉比表面积为277.30 cm2/g，孔径为5～20 nm，吸水率为74.40%，pH值为7.50，化学成分：81.01% SiO2，7.84% Al2O3，1.68% Fe2O3，0.60% CaO，0.59% MgO，8.28%其他成分[1]。试验所用纳米硅藻页岩粉由黑龙江广拓农业科技有限公司提供。

1.2 試验设计

本试验采用的方法是大区对比法，不设重复，共设置4个处理：常规施肥（CK），常规施肥+150 kg/hm2纳米硅藻页岩粉（DS150），常规施肥+300 kg/hm2纳米硅藻页岩粉（DS300），常规施肥+600 kg/hm2纳米硅藻页岩粉（DS600）。每个处理区面积约为420 m2，各区间隔1.5 m。常规施肥采用水稻专用复合肥（N、P2O5、K2O比例为12 ∶ 18 ∶ 15），施基肥、追肥时使用。纳米硅藻页岩粉的施用方法是在施基肥时与复合肥混合后施入土壤，追肥时不施加纳米硅藻页岩粉。2017年5月初进行农田土壤翻耕，5月10日于田间土壤中施用基肥，基肥用量为938 kg/hm2，5月13日插水稻秧苗，每穴插入2～3株，株距为13 cm，行距为30 cm，分蘖期追施1次复合肥，其施用量为562 kg/hm2。各处理区均采用传统水分管理模式（前期淹水、中期烤田、后期干湿交替）。其他田间管理同当地常规栽培规范，试验期间严格控制田间草、虫、病害。

1.3 样品的采集与测定方法

2017年9月5日采集各處理区耕作层0～20 cm的土壤，采集前先去除附着在水稻土壤表面的凋落物及杂石等，将采集到的土样装入自封袋中密封，并置于带冰的保温箱中带回实验室，放入4 ℃冰箱并取出一部分新鲜土壤，立即用于Biolog试验。

用Biolog-Eco微孔板（Biolog Eco PlateTM）进行测定。Biolog板内有31种碳源孔，分别是β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖酸-γ-内酯、D-木糖、D-半乳糖醛酸、i-赤藓糖醇、D-甘露醇、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-葡糖胺酸、D-纤维二糖、1-磷酸葡萄糖、D，L-α-磷酸甘油、α-D-乳糖、L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、丙酮酸甲酯、γ-羟丁酸、衣康酸、α-丁酮酸、D-苹果酸、吐温40、吐温80、肝糖、α-环式糊精、2-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、苯乙基胺、腐胺。称取5 g鲜土于45 mL 0.85% NaCl溶液中，于200 r/min摇床中振荡40 min，静置20 min后取上清液，之后再加入NaCl溶液，反复振荡、静置、取上清液至土壤样品被稀释为10-3。吸取150 μL稀释液于Biolog-Eco微孔板中，在25 ℃恒温培养箱中连续培养10 d，每隔24 h用Elx800TM酶标仪分别测定590、750 nm波长处的吸光度[13-14]。

1.4 数据处理与统计分析

土壤微生物群落代谢活性用单孔的平均颜色变化率（average well color development，简称AWCD）来表示，需要用培养10 d的全部数据，单孔吸光度为波长为590 nm的吸光度减去波长为750 nm的吸光度（590 nm代表颜色+浊度的波长，750 nm 代表浊度的波长），若所得数值小于0.06，则不作统计计算[15]。选择培养96 h的数据[16]进行单因素方差分析（ANOVA）、多重比较[最小显著性差异法（LSD），α=005]、主成分分析、功能多样性指数的计算[17]、6类碳源底物吸光度的计算[17]。使用Excel 2010、SPSS 20.0进行数据统计和作图，数据表示为“平均值±标准差”。

2 结果与分析

2.1 纳米硅藻页岩对水稻土壤微生物活性的影响

Biolog-Eco微孔板内31孔碳源的AWCD值是衡量土壤微生物群落利用单一碳源能力的重要指标，能够反映土壤微生物的代谢活性，AWCD值越高，表明土壤微生物对碳源的利用程度越高，微生物的代谢活性越强[18]。由图1可看出，随着培养时间的延长，土壤微生物对碳源的利用程度越高，吸光度在培养至48 h时的变化速率最大，随后吸光度逐渐增加，到培养 240 h 时基本稳定。从培养48 h开始，DS300处理的土壤AWCD值均高于其他3个处理，DS600处理均明显低于其他3个处理，表明施用纳米硅藻页岩能够影响土壤微生物对碳源的利用。在培养240 h时，4个处理的AWCD值排序为DS300>CK>DS150>DS600，经方差检验，DS300处理的AWCD值为1.035，显著高于CK处理的AWCD值（0.977，P<005），DS600处理的AWCD值为0.771，显著低于CK处理（P<005），而DS150处理与CK相比差异不显著。以上试验结果表明，施用剂量为300 kg/hm2的纳米硅藻页岩能够提高土壤微生物的代谢活性。

2.2 纳米硅藻页岩对水稻土壤微生物群落多样性指数的影响

对Biolog-Eco板培养至96 h的吸光度进行4种多样性指数分析，可以反映土壤微生物群落在不同纳米硅藻页岩施用量处理下的微生物群落代谢的差异[16]。Shannon指数常用于表征土壤微生物群落的多样性，Simpson指数常用于表征微生物群落的优势度，McIntosh指数可以反映微生物群落的均匀度，Richness指数则可用于反映微生物群落的丰富度情况[19-20]。由表1可以看出，Shannon指数、Simpson指数、Richness指数在各处理间的排序均为DS300>CK>DS150>DS600，表明DS300处理可以提高土壤微生物群落的多样性。方差检验结果表明，施用高剂量的纳米硅藻页岩处理的McIntosh指数、Shannon指数显著低于其他处理（P<0.05），在其他指数上差异均不显著，表明高施用量的纳米硅藻页岩会显著降低土壤微生物群落的均匀度和多样性。

2.3 纳米硅藻页岩对水稻土壤微生物利用6类碳源的影响

对Biolog-Eco微孔板内的31种碳源进行分类， 可分成6类，分别计算4种处理下这6类碳源的平均吸光度（6类碳源的吸光度测定波长均为590、750 nm），可以反映土壤微生物对不同碳源利用效率的差异[21]。如表2所示，DS300处理对碳水化合物、氨基酸、羧酸和多聚物的利用程度最高，经方差检验，DS300、DS150处理对碳水化合物类碳源的利用效果显著高于对照处理，表明施用合适剂量的纳米硅藻页岩能够提高土壤微生物对碳水化合物类碳源的利用能力，可以促进喜食碳水化合物类碳源微生物的生长。

2.4 纳米硅藻页岩各处理土壤微生物在31孔碳源上的主成分分析

Biolog-Eco微孔板能够提供土壤微生物对板内31种碳源的利用信息，每种碳源相当于1个变量，由于微生物对有些碳源的利用方式是相似的，所以这些数据会存在大量重复信息。为了有效利用数据，对31种碳源采用降维的方式，可以找到代替较多原有变量的较少新变量[22]，从而明确不同纳米硅藻页岩施用量处理下土壤微生物类群的差异。主成分分析方法要求各主成分的累积方差贡献率大于85%才能够有效地反映真实情况。因此，为了能使主成分累积贡献率达到85%以上，本研究采用4个主成分进行分析。

由表3可知，PC1～PC4累積方差贡献率达99.00%，方差贡献率大于85%，因此这4个主成分能够反映31种碳源的全部信息。将与PC1～PC4上相关性较大的碳源，即相关性的绝对值大于0.50的碳源列在表4中。可以看出，PC1主要代表13种碳源，PC2主要代表11种碳源，PC3主要代表6种碳源，PC4主要代表5种碳源，说明这4个主成分能够包含31种碳源的全部信息。

由表5可知，各处理在PC1、PC2上的得分均较高，DS150、DS300和CK处理均在PC1的正方向，而DS600处理在PC1的负方向，说明PC1所代表的碳源能够很好地将DS150、DS300、CK处理与DS600处理分辨开，DS150、DS300、CK处理与DS600处理的微生物群落结构存在明显差异。

主成分分析结果表明，施用高剂量的纳米硅藻页岩后，微生物对碳源的利用有了很大改变。DS150、CK处理均在PC1的正方向和PC2、PC3、PC4的负方向上，说明DS150处理与CK处理的微生物群落结构最相似，表明施用低量的纳米硅藻页岩后，微生物对碳源的利用没有发生明显改变。DS300处理在PC1的正方向上得分最高，说明DS300处理对PC1所代表的碳源利用程度最高，表明施用适量的纳米硅藻页岩可以提高微生物对PC1代表的碳源的利用率。

3 结论与讨论

Biolog-Eco微孔板能够快捷、敏感地反映土壤微生物的变化特征，对其进行数据分析时，选择AWCD值、多样性指数、6类碳源的利用率及主成分分析方法能够有效提取信息[17]。对AWCD值的分析结果显示，培养至24 h时，各处理

的AWCD值均几乎为0，且差异不显著，这是由于土壤中存在一些如自生固氮菌、硝化和亚硝化等生长较慢或完全没有增殖的微生物[9]。从培养48 h开始，AWCD值快速增长，DS300处理明显高于其他处理，到培养240 h时AWCD值稳定。分析表明，施用不同量纳米硅藻页岩的土壤微生物活性排序表现为DS300>CK>DS150>DS600，其中DS300、DS600处理与对照处理相比差异显著，表明施用中剂量的纳米硅藻页岩会提高土壤微生物的活性，施用高剂量的纳米硅藻页岩会对土壤微生物代谢活性有明显的抑制作用。这与蔡燕飞等施用同类物质的研究结果[23]相似。产生这样的结果可能的原因是施用中量纳米硅藻页岩时，因纳米硅藻页岩表面有丰富的毛孔状结构，可以增加土壤的保肥能力和土壤含氧量[4]，从而促进微生物的生长，进而提高土壤微生物的代谢活性。

土壤微生物是土壤中最为活跃的组成部分，微生物代谢活性增强，表明施用中量纳米硅藻页岩对土壤改良有一定的作用。而施用高剂量的纳米硅藻页岩，会造成土壤中重金属含量的积累（纳米硅藻页岩中含有少量的铁、锰等重金属元素[1]），由于重金属对土壤微生物具有一定的毒害作用[24]，因而造成土壤微生物代谢活性的显著降低。因此可见，纳米硅藻页岩的合理施用才可以促进土壤微生物的生长，提高水稻土壤微生物的活性，从而提升土壤的肥力水平。

对土壤微生物碳源利用多样性的指数分析结果显示，微生物碳源利用的Shannon指数、Simpson指数和Richness指数在各处理中均表现为DS300处理最高，说明施用中量的纳米硅藻页岩有提高土壤微生物多样性的潜力。DS300处理的多样性指数、优势度指数和丰富度指数最高，DS300处理能够显著促进喜食碳水化合物类碳源的微生物群落生长。主成分分析结果显示，CK、DS150、DS300处理土壤微生物的群落结构相近，而DS600处理与其他处理土壤微生物的群落结构明显不同，说明DS600处理显著改变了土壤微生物的群落结构，可能是导致土壤微生物群落活性的显著降低及碳源代谢能力减弱的原因。因此可见，合理确定纳米硅藻页岩的施用剂量，建立标准的使用方法，有利于纳米硅藻页岩农业规模化的应用，充分发挥纳米硅藻页岩自身的优势，合理利用该项资源及有效规避使用风险。

Biolog技术虽然简便、省时、高效，但仅从土壤微生物的代谢信息获得微生物群落结构的信息，因此还存在一定的局限性，且使用该技术培养的微生物总数有限，土壤中那些难培养或不可培养的微生物群落代谢活性和土壤微生物对碳源的利用在该技术中响应程度不高[25]。因此在后续研究中，在研究微生物群落多样性时使用Biolog技术，也应该配合其他技术作辅助分析，如变性梯度凝胶电泳技术[26]、宏基因组技术[27]、Illumina高通量测序技术[28]等，从分子水平上研究纳米硅藻页岩对农田土壤生态系统的影响，为提高土壤质量和农田生态系统的稳定性提供科学依据。

本研究应用Biolog-Eco技术，研究不同施用量的纳米硅藻页岩对土壤微生物的代谢活性、碳源代谢多样性的影响。结果表明，合理施用纳米硅藻页岩对维持水稻土壤生态系统的稳定具有积极影响。不同施用量纳米硅藻页岩处理的AWCD值、多样性指数、优势度指数和丰富度指数均表现为中施用量提高，低施用量无影响，高施用量显著降低。在对6类碳源的利用中，DS300、DS150处理土壤微生物对碳水化合物类碳源的利用显著高于对照、DS600处理。主成分分析结果表明，DS300处理对PC1代表的碳源的利用程度最高。当纳米硅藻页岩的施用量为300 kg/hm2时，能够提高水稻土壤微生物的代谢活性和碳源代谢多样性，对于改善农田土壤肥力有重要意义，纳米硅藻页岩矿物资源在农业上具有十分广阔的发展前景和应用潜力。关于纳米硅藻页岩的直接施用是否能提高水稻产量和水稻品质，有待于进一步试验研究。

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