袁斌 吕美云 刘紫英

摘要：分离纯化宜春温泉泉水中的嗜热菌并鉴定分析其系统发育多样性。将宜春温泉水在嗜热菌分离培养基上进行多次分离纯化，液体扩大培养，提取DNA、16S rRNA进行PCR扩增，将其序列送往公司检测，经Blast分析和比对，对检测结果进行系统发育分析。结果表明，宜春温泉泉水中分离并鉴定42株中度嗜热细菌。宜春温泉菌群系统发育中，以芽孢杆菌类群为主;其中，解硫胺素芽孢杆菌属（Aneurinibacillus）和土样芽孢杆菌属（Geobacillus）占主导，其次是短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、无氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）。

关键词：温泉;嗜热菌;分子鉴定;系统发育分析

中图分类号： S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）05-0199-05

收稿日期：2017-11-06

基金项目：江西省科技厅青年科学基金（编号：20142BA214011）。

通信作者：刘紫英（1979—），女，江西萬年人，硕士，副教授，从事微生物工程技术研究。E-mail：yingziliu2008@163.com。

嗜热微生物是指生长温度上限高于50 ℃的微生物，研究嗜热菌可以探索高温环境中微生物的种类和多样性[1]，更重要的是可以利用和开发嗜热菌在耐热机制、环境保护、工业应用、资源开发等方面应用[2]，使其具有非常重要的意义。

对热泉中的微生物资源研究国内外已有相关报道[3-5]。我国南部、西部和北部地区的热泉中嗜热微生物等资源已探索[6-8]，根据厦门温泉不同于内陆温泉和深海热液喷口的特点，杨波等发现了一些新的嗜热菌，为探索厦门地区新的微生物资源提供依据[9]。辽宁鞍山温泉的水样表明，中温环境中以中度嗜热菌芽孢杆菌属（Bacillus）为主，对其嗜热酶进行了定性分析[10]。以上研究表明，国内的温泉中蕴藏着丰富的嗜热菌，为开发相关嗜热酶提供了前景。

宜春温泉水温常年维持在68～72 ℃之间，具有独特的高硒低硫水质，是迄今全球仅有的高硒且低硫的温泉[11]。泉水中的嗜热菌更是具有对泉水的净化和维稳作用。嗜热菌对高温有着较强适应性，通过对温泉中嗜热微生物的分析，能够充分了解高温环境中微生物的多样性及其功能多样性，使其具有重大的意义。本试验将宜春温泉泉水中嗜热菌的多样性进行研究分析，并且对各菌种之间的相关性进行比对。这一分析为了解温泉中的生态平衡提供了有力的证据，同时也为进一步开发、利用内陆温泉中的嗜热微生物提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

样品来自于江西省宜春市宜春镇富硒温泉，宜春富硒温泉位于115°E、28°N，坐落在江西省明月山风景区，国家AAAA级风景区。在温泉中心及周围5个样点取样，同时检测温泉的温度、pH值等;样品采集后装入无菌50 mL离心管中，4 h之内于4 ℃保存运回实验室，低温保藏待用。

2个泉水口，分别标记为宜春新井和宜春老井，实测温度均为60 ℃，pH值为6.0。采样时间为2014年5月3日：每个温泉水样各5管，运抵实验室后4 ℃密闭保存待用。

1.2 主要试剂与仪器

DNA marker、16S rRNA扩增引物（27F：5′-ATTCCGGTTGATCCTGC-3′;1541R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）、Goldview Ⅱ型核酸染料、Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

主要仪器设备有温度梯度PCR仪（伯乐）、超低温冰箱（美菱）、水平凝胶电泳仪（北京六一DYCP-32A）、生化培养箱（LRH-250A）、凝胶成像仪（伯乐）等。

1.3 培养基

根据样品温泉的温度，选择TYE培养基作为富集培养基，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。嗜热菌分离培养基TYE：1.3 g/L（NH4）2SO4、0.28 g/L KH2PO4、0.25 g/L MgSO4·7H2O、0.07 g/L CaCl2·2H2O、1.8 mg/L MnCl2·4H2O、4.5 mg/L Na2B4O7·10H2O，0.05 mg/L CuSO4·2H2O，0.22 mg/L ZnSO4·7H2O，0.01 mg/L CoCl2，0.03 mg/L Na2MoO4·2H2O，5.0 g/L酵母浸膏（yeast extract），4.0 g/L胰蛋白胨（tryptone），1 L超纯水，22 g琼脂粉，pH值为7.2。

1.4 方法

1.4.1 嗜热菌的分离纯化 温泉水样品：将从宜春市宜春镇富硒温泉中取得的2处水样，经过压滤处理后，滤膜（0.22）加入到已灭菌的TYE液体培养基中，在温度为55 ℃条件下摇瓶培养，于恒温水浴摇床上培养3 d，至出现混浊;培养液梯度稀释后涂布TYE平板，55 ℃温箱培养，待形成明显菌落后，再依据形态菌落特征挑取单菌落。每一个单菌落转接摇管，在相同条件下将细菌液梯度稀释，然后采用稀释涂布平板法分离细菌，重复多次，直到得到单菌落，挑取平板中的单菌落，根据菌落形态特征进行编号。宜春温泉泉水中分离出的菌株，宜春新井编号为N11、N12、N1202、N1209、N9、N1211、N1212、N1213、N1214、N1216、N1221、N22、N1222、N23、N1224、N24、N1230、N1233、N13、N3、N14、N15、N17、N18、N28、N2、N4、N5、N8、N19、N20、N25、N26、N27、N29;宜春老井编号为O2104、O2108、O2111、O2112、O2202、O2203、O2212。

1.4.2 细菌基因组DNA的提取 挑选每个编号的单个菌落，分别接种到液体培养基中，55 ℃恒温摇床培养10 h，测定D值并检测菌体浓度后，用细菌基因组DNA的提取用试剂盒提取总DNA。参考试剂盒的操作說明书进行提取DNA。

1.4.3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 取待检测的样品5 μL与1 μL 10×DNA Loading Buffer均匀混合，琼脂糖水平凝胶电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TAE，电泳电压为75 mV。

1.4.4 16S rDNA基因的PCR扩增和产物纯化 选择细菌通用引物上游引物（27F：5′-ATTCCGGTTGATCCTGC-3′），下游引物（1 541R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）;PCR反应体系：12.5 μL 2×Taq PCR Master，上下游引物各 0.5 μL，DNA模板1.5 μL，补足水至25 μL;扩增条件为：94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s，56.4 ℃ 45 s，72 ℃ 100 s，30个循环;72 ℃延伸 10 min。由上海生工生物工程（上海）股份有限公司协助将本试验所得的PCR扩增产物纯化及测序。

1.4.5 嗜热菌的分子鉴定及系统发生关系分析 进入NCBI官网，上传测序的序列获取菌株序列号（KY433292～KY433310、KY433860～KY433882），经Blast查询已测序列的同源序列，筛选并下载与其相似度较高的菌株序列并将其作为参考序列，记录相似序列的GenBank收录号、与原序列的相似度、分值（分值表示2株菌株相似性的参考值，数值越大，相似度越高）。用软件Mega 6.0进行序列分析，Neighbour-Joining法构建系统发育树，并且在其分枝上标出自展检验Bootstrap值（1 000次重复获得）。

2 结果与分析

2.1 宜春温泉泉水中嗜热菌的分离纯化

从宜春温泉泉水中分离纯化近150株嗜热菌，经形态初步鉴定筛选，最后DNA琼脂凝胶电泳检测到PCR扩增，有42个编号的菌体测序成功（35个新井、7个老井），所以本研究的最终结果只选取与测序成功的编号相关内容进行分析讨论。

2.2 宜春温泉泉水中嗜热菌DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

由图1可知，嗜热菌经试剂盒提取DNA后电泳显示了良好的效果，显示条带很亮，但也有一些拖尾现象，估计是少量蛋白没有完全清除干净，但结果不影响下一步的PCR扩增。

2.3 宜春温泉泉水中嗜热菌的PCR扩增

由图2可知，提取后的DNA经过PCR扩增后，每条条带扩增的大小与marker比较在1 600 bp左右，符合16S rRNA的大小，扩增成功，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

2.4 在NCBI中的Blast结果

分离纯化得到42株不同表型的嗜热细菌菌株，通过Blast比对分析其16S rRNA序列，由表1可知，嗜热菌归属于5个属11种：土样芽孢杆菌属（Geobacillus）的嗜热脂肪土芽孢杆菌（G. stearothermophiluspartial）、喜热嗜油地芽胞杆菌（G. thermoleovorans）、土芽孢杆菌（Geobacillus sp.）、嗜热地芽孢杆菌（G. kaustophilus）;解硫胺素芽孢杆菌属（Aneurinibacillus）的嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌（A. thermoaerophilus）;短芽孢杆菌属（Brevibacillus）的波斯坦短芽孢杆菌（B. borstelensis），嗜热短芽孢杆菌（B. thermoruber）;芽孢杆菌属（Bacillus）的地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）、芽孢杆菌（Bacillus sp.）;无氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）的A. lavithermus、努比卤地无氧芽孢杆菌（A. rupiensis），其中土样芽孢杆菌属（Geobacillus）和解硫胺素芽孢杆菌属（Aneurinibacillus）是优势属，均占 23.8%，其次是短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、无氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）分离最少。从采样地分析，新井的群落多样性更丰富，新井中分离有短芽孢杆菌属、土样芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、无氧芽孢杆菌属、解硫胺素芽孢杆菌属;老井仅分离到短芽孢杆菌属、土样芽孢杆菌属、芽孢杆菌属这3个属;这估计与旧井的过度开放有关，取水过度，造成菌群多样性丰度小。

2.5 嗜热菌的分子鉴定及系统发育分析

由表1与图3可知，从宜春温泉泉水中能够分离出一定数量且不同类群的嗜热菌，表明嗜热菌能够在温泉这种特殊的环境中生存，并且广泛存在。从温泉泉水中分离得到的这批嗜热菌中N1202、N1221、O2108、O2202、O2212、N11、N14、N17、N4属于短芽孢杆菌属;N1209、N1211、N1212、N1213、N1214、N1216、N1222、N1233、O2104、O2203属于土样芽孢杆菌属;N1224、O2111、O2112、N27、N5属于芽孢杆菌属;N1230、N12、N18、N19、N28、N2、N9、N13属于厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）;N3、N8、N15、N20、N22、N23、N24、N25、N26、N29属于解硫胺素芽孢杆菌属（Aneurinibacillus）。

从分析结果可以看出，150株分离纯化菌株中获得42种基因型菌株，宜春温泉中的嗜热菌为中度嗜热细菌，以芽孢杆菌类群为主，具体为土样芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、厌氧芽孢杆菌属、解硫胺素芽孢杆菌属。其中，优势菌群为土样芽孢杆菌属和解硫胺素芽孢杆菌属，均占23.81%。上述分析结果说明，解硫胺素芽孢杆菌属和土样芽孢杆菌属在宜春温泉的微生态系统中处于优势地位。短芽孢杆菌属占总菌群数量的21.4%、厌氧芽孢杆菌占19.05%，为次要菌群，芽孢杆菌属约占总菌株数的11.90%，为最少的菌群。本研究结果与李杨霞等在四川、陕西温泉报道菌株主要分布在厌氧芽孢杆菌属和土样芽孢杆菌属有其相似性，都分离有厌氧芽孢杆菌属和土样芽孢杆菌属，且为优势菌[12]。本研究结果与Maugeri等报道土样芽孢杆菌属在60 ℃左右的中等高温条件下一般处于优势地位的报道是一致的，土样芽孢杆菌属是中度嗜热的芽孢杆菌分支属，广泛存在各地热泉中[13]。本研究分离纯化得到的嗜热菌菌株结果是不同于在福建和云南省的国内研究者的报道。郭春雷等对云南温泉的嗜热菌报道显示，在滇西二泉中栖热菌属（Thermus）的高温菌株为优势菌群[14]。综上结果表明，嗜热菌的菌群分布与其地理位置有密切关系，不同地域的嗜热菌优势菌呈现不一。

3 讨论与结论

通过可培养法富集分离宜春温泉泉水中的嗜热菌，进而分离纯化、利用16S rRNA分子鉴定其菌株，分析温泉中嗜热菌的系统发育，在嗜热微生物分類学中从分子时钟水平来分析其系统发育地位并确定宜春温泉泉水中的优势菌群，且通过这些优势菌群的特性，更好地了解和发掘温泉中有益的功能菌，使其发挥巨大作用。然而，可培养法获得的嗜热微生物非常有限，本结果获得的嗜热短芽孢杆菌（B. thermoruber）、波斯坦短芽孢杆菌（B. borstelensis）、嗜热脂肪土芽孢杆菌（G. stearothermophi luspartial）、喜热嗜油地芽胞杆菌（G. thermoleovorans）、土芽孢杆菌（Geobacillus sp.）、嗜热地芽孢杆菌（G. kaustophilus）;地衣芽孢杆菌（B. licheniformis），芽孢杆菌（Bacillus sp.）;A. lavithermus、努比卤地无氧芽孢杆菌（A. rupiensis）、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌（A. thermoaerophilus）等11种嗜热菌。这个结果与进一步采用非培养法，利用高通量测序技术检测宜春泉水中细菌群落结构与多样性有些差异。高通量测序技术对水体样品物种类群结果显示，主要属于不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、水栖菌属（Enhydrobacter）、Thermosynechococcu、鞘脂杆菌属（Sphingobacterium）和金黄杆菌属（Chryseobacterium）;这也为以后采用多种培养基分离培养嗜热菌提供一个思路， 随着分子生物学技术的推进，嗜热微生物多样性探索可以拓展到更多嗜热菌，同时对嗜热微生物系统发育分析提供一个更好的方向。

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