魏朝治 裘纪莹 陈蕾蕾 陈相艳 刘孝永 辛雪

摘要：研究具有生物转化银杏花粉黄酮苷活性的恶味乳杆菌B2的益生特性和安全性。结果表明，该菌具有较好的β-葡萄糖苷酶活性和体外脱除胆固醇能力，对酸和人工模拟胃液的耐受性较好，而对胆盐和人工模拟肠液的耐受性一般;同時该菌对10种常见抗生素不具有耐药性，并且不携带耐药基因，不具备硝酸盐还原酶、氨基脱羧酶活性，不产生吲哚等有害代谢产物，因此该菌安全性较高。

关键词：恶味乳杆菌B2;β-葡萄糖苷酶;益生特性;安全性;耐药性

中图分类号： TS201.3  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）05-0162-04

收稿日期：2017-12-11

基金项目：山东省农业科学院创新工程（编号：CXGC2017B06）;山东省泰山学者工程项目;山东省农业科学院青年英才培养计划;山东省自然科学基金三院联合基金（编号：ZR2014YL020、ZR2016YL022）。

作者简介：魏朝治（1992—），男，山东济宁人，硕士研究生，主要从事食品微生物研究。E-mail：wczwcz0220@163.com。

通信作者：辛 雪，助理研究员，主要从事农产品加工研究。E-mail：jasmine811201@126.com。

乳酸菌（lactic acid bacteria，简称LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌通称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，是公认的安全性菌株（generally recognized as safe，简称GRAS）。乳酸菌不仅可应用于食品发酵行业，同时也能调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡等，与机体的生命活动息息相关[1]。但近年来研究发现，一些乳酸菌具有抗生素抗性，甚至有些菌株出现了多重耐药性[2]。

恶味乳杆菌B2是从手工泡菜中筛选到的1株能够生物转化银杏花粉黄酮苷的优良菌株，其培养条件简单，易存活，产酸能力适中，口感较好，可用于活菌型功能性银杏花粉产品的研制。但目前文献报道缺乏关于恶味乳杆菌益生特性和安全性方面的研究。因此，本试验以自主分离的1株恶味乳杆菌B2为研究对象，以β-葡萄糖苷酶活性、降解胆固醇能力以及耐酸、耐胆盐、耐模拟肠胃液能力和耐药性、有害代谢产物分析等为手段，开展其益生特性和安全性评价，旨在为进一步开发恶味乳杆菌资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株来源 试验用菌株为恶味乳杆菌B2，是由笔者所在实验室自手工泡菜中分离得到的1株能够转化银杏花粉黄酮苷的优良菌株。

1.1.2 培养基与试剂 乳酸细菌（MRS）培养基[3]用于菌株活化、培养，MRS-胆固醇（MRS-CHOL）培养基[4]用于体外降解胆固醇试验，药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司，对硝基苯酚（p-NP）、对硝基苯基β-D-葡萄糖苷（p-NPG）、磷酸氢二钠、柠檬酸等均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备 CR22GⅢ高速冷冻离心机，日本日立公司生产;SHP-150生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司生产;Mettler AE240电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产;UV-160型紫外可见分光光度计，日本岛津公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化与培养 将菌株划线接种于MRS固体培养基上，37 ℃培养24 h，挑单菌落活化传代2次，经革兰氏染色观察为纯菌后，接种于5 mL MRS液态培养基中，37 ℃静置培养16 h。

1.2.2 β-葡萄糖苷酶活性的测定[5] 粗酶液的制备：将发酵液在8 000 r/min条件下离心20 min，沉淀用pH值为6.0的磷酸氢二 钠- 柠檬酸缓冲液洗涤2遍，离心去上清，沉淀溶于相同缓冲液中，在0 ℃条件下超声间歇粉碎15 min后，10 000 r/min、4 ℃离心20 min，上清液为粗酶液。对硝基苯酚标准曲线的绘制：精准称取0.139 mg对硝基苯酚纯品，溶解于1 mL甲醇溶液中，用pH值为6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容到 100 mL，再稀释为5.0、12.5、25.5、37.5、50.0、75.0 μmol/L等浓度梯度溶液;取100 μL稀释后的pNP溶液，加入100 μL 1 mol/L的Na2CO3溶液，测定其在405 nm处的吸光度，绘制对硝基苯酚标准曲线。β-葡萄糖苷酶活性的测定：将20 μL 25 mmol/L的p-NPG加入到80 μL的粗酶液中，在室温下进行反应，30 min 后加入100 μL浓度为 1 mol/L 的Na2CO3溶液终止反应，测定其在405 nm处的吸光度。根据对硝基苯酚标准曲线回归方程计算生成的对硝基苯酚浓度。一个β-葡萄糖苷酶活性单位（U）定义为在一定的反应条件下，每分钟分解对硝基苯基β-D-葡萄糖苷底物生成1 μmol对硝基苯酚（p-NP）所需要的β-葡萄糖苷酶量。计算公式如下：

U=pNP浓度×反应总体积反应时间×酶液体积×稀释倍数。

1.2.3 体外降解胆固醇能力试验 恶味乳杆菌B2体外降解胆固醇能力的测定参照文献[4]进行。胆固醇工作液的配制：量取一定量的胆固醇配制胆固醇贮存液，并进一步稀释，使胆固醇工作液的终浓度分别为50、100、150、200、250、300、350 μg/mL。标准曲线的制作：取胆固醇工作液和铁铵显色剂各2.5 mL振荡摇匀后，冷却至室温，以冰乙酸加显色剂为空白对照，于560 nm处测定吸光度，以D560 nm为纵坐标，胆固醇含量为横坐标绘制标准曲线。胆固醇含量的测定采用硫酸铁铵法。在MRS-胆固醇（MRS-CHOL）液体培养基中接入1%（体积比）的乳酸菌，37 ℃培养24 h，离心（8 000 r/min、4 ℃、10 min），获取上清液;用5 mL去离子水洗涤菌体沉淀（2次），离心（8 000 r/min、4 ℃、10 min），获得沉淀洗涤液;分别取上清液和沉淀洗涤液0.3 mL于离心管中，加入3.7 mL冰乙酸充分混匀，13 000 r/min离心 5 min;取上清液2.5 mL于试管中，沿管壁缓缓加入2.5 mL铁铵显色液，室温静置 20 min，然后充分振荡摇匀，测定D560 nm。以未接种乳酸菌的MRS-CHOL培养基代替发酵液为空白。胆固醇的降解率按以下公式计算：

胆固醇的降解率=D空白-D样品D空白×100%。

1.2.4 耐酸、耐胆盐和耐模拟胃肠液试验 参照高盛等的方法[6-7]测定恶味乳杆菌B2的耐酸、耐胆盐、耐模拟胃肠液能力。耐酸试验：將发酵液在8 000 r/min条件下离心20 min，沉淀用0.85%生理盐水洗涤2遍，离心去上清，沉淀重悬于等体积生理盐水中，制成菌悬液。分别将上述菌悬液接种于pH值为1.5、2.5、3.5、4.5的MRS液体培养基中，37 ℃条件下培养0、2、4、6 h，培养后取一定量梯度稀释涂布于MRS平板，37 ℃静置培养48 h后活菌计数，每个稀释度作3个平行。耐胆盐试验：将发酵液在8 000 r/min条件下离心20 min，沉淀用0.85%生理盐水洗涤2遍，离心去上清，沉淀重悬于等体积生理盐水中，制成菌悬液。分别将上述菌悬液接种于含不同浓度牛胆盐的MRS液体培养基（牛胆盐质量分数分别为0%、0.1%、0.2%、0.3%）中，37 ℃条件下培养0、2、4、6 h，培养后取一定量梯度稀释涂布于MRS平板，37 ℃条件下静置培养48 h后活菌计数，每个稀释度作3个平行。耐模拟胃肠液试验：将胃蛋白酶过滤除菌，加入到灭菌的0.5% NaCl溶液中，胃蛋白酶终浓度为3 g/L，分别调节溶液pH值至1.5、2.5、3.5，即为供试的人工胃液;将胰蛋白酶和牛胆盐过滤除菌，加入到灭菌的0.5% NaCl溶液中，胰蛋白酶和牛胆盐终浓度均为 1 g/L，调节溶液pH值至8.0，即为人工肠液;将发酵液在8 000 r/min条件下离心20 min，弃上清，沉淀重悬于MRS液体培养基中，加入等体积的人工胃液或人工肠液，37 ℃ 条件下培养0、2、4、6 h，培养后取一定量梯度稀释涂布于MRS平板上，37 ℃静置培养48 h后活菌计数，每个稀释度作3个平行。

1.2.5 耐药性评价 药敏试验：采用药敏纸片琼脂扩散法进行药敏试验[8]。将100 μL待测菌液均匀涂布于MRS固体平板上，待菌液被完全吸收后放置药敏纸片。供试药敏纸片：购自杭州微生物试剂有限公司，纸片上附有抗生素分别为青霉素、万古霉素、庆大霉素、红霉素、四环素、氯霉素、链霉素、阿莫西林、诺氟沙星、卡那霉素。质粒提取试验：取5 mL待测菌液，使用OMEGA公司质粒提取试剂盒提取质粒;取提取好的质粒液体5 μL加入1 μL 6×Loading buffer，点样于琼脂糖凝胶进行电泳，电泳液为1×TAE溶液，电压为100 V，运行 30 min，电泳结束后，置于254 nm紫外灯下观察。

1.2.6 有害代谢产物试验 吲哚试验：将菌液以2%（体积比）接种量接种于蛋白胨水培养基中，37 ℃培养48 h，滴加吲哚试剂，观测颜色变化情况，以不接菌液的蛋白胨水培养基为空白对照，试验作3次平行。硝酸盐还原酶试验：将菌液以2%（体积比）接种量接种于硝酸盐培养基中，37 ℃条件下培养48 h，滴加碘化钾溶液和淀粉溶液，观察颜色变化情况，以不接菌液的硝酸盐培养基为空白对照，试验作3次平行。氨基脱羧酶活性检测：将菌株划线于添加前体氨基酸（L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸）的脱羧酶筛选平板上，以未添加前体氨基酸的脱羧酶筛选平板为对照，37 ℃条件下培养48 h后，观察培养基颜色变化情况，试验作3次平行。

2 结果与分析

2.1 恶味乳杆菌B2的β-葡萄糖苷酶活性

β-葡萄糖苷酶又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，释放 β-D-葡萄糖和相应的配基。研究显示，β-葡萄糖苷酶在生物转化黄酮苷中有重要应用，同时，很多生物转化黄酮苷优良菌株具有分泌β-葡萄糖苷酶能力[9-11]。恶味乳杆菌B2能够高效转化银杏花粉黄酮苷，因此检测其β-葡萄糖苷酶活性，可为转化机制研究提供参考。

2.1.1 对硝基苯酚标准曲线 以p-NP浓度为横坐标，D405 nm为纵坐标，取3次测量的平均值绘制标准曲线，结果见图1，标准曲线回归方程为y=0.010 9x+0.002 4，r2=0.999。

2.1.2 β-葡萄糖苷酶活性 恶味乳杆菌B2粗酶液经3次平行试验后，测得的D405 nm值为0.283±0.002 7。将数据代入p-NP标准曲线回归方程计算得到，生成的对硝基苯酚浓度为（25.74±0.01） μmol/L。通过计算得到恶味乳杆菌B2的β-葡萄糖苷酶活性为16.09 U。

2.2 恶味乳杆菌B2的耐酸、耐胆盐和耐模拟胃肠液能力

2.2.1 耐酸能力 人体胃液中胃酸的pH值一般在1.5～3.5 之间[7]。从图2可以看出，恶味乳杆菌B2在pH值为35时表现出良好的酸耐受性，6 h内活菌数无明显变化;在pH值为2.5时，每隔2 h，活菌数下降2个数量级，6 h后活菌数下降了6个数量级;当pH值为1.5时，2 h后活菌数下降了6个数量级，4 h后已无活菌检出。说明该菌对酸的耐受性较好，在酸性环境下仍可存活较长时间并保持生长。

2.2.2 耐胆盐能力 小肠中胆盐浓度一般为0.1%～0.3%肠内容物[12]。从图3可以看出，恶味乳杆菌B2在胆盐浓度为0.1%时表现出较好的耐受性，6 h内活菌数与不加胆盐相比无明显差异;在胆盐浓度为0.2%时，2 h后活菌数下降了3个数量级，6 h后无活菌检出;在胆盐浓度为0.3%时，2 h后无活菌数检出。说明恶味乳杆菌B2的胆盐耐受性一般，当胆盐浓度达到0.3%时，该菌无法存活。

2.2.3 耐模拟胃肠液能力 胃液中含有胃蛋白酶和胃酸，所以胃液是一个富含蛋白酶并且低pH值的环境。人体摄入食物后，胃液的pH值会随着胃酸的分泌和消耗在1.5～3.5之间波动。肠液里不仅富含胰蛋白酶和胆盐，而且还是一个微碱环境。胃肠液中存在的酶、胆盐以及酸碱环境对乳酸菌生长都有抑制作用。从图4可以看出，在pH值为3.5的人工模拟胃液中，活菌数在6 h内没有明显变化，都保持在同一数量级。在pH值为2.5的人工模拟胃液中，6 h后活菌数下降了5个数量级。在pH值为1.5的人工模拟胃液中，4 h后已无活菌检出。而在pH值为8.0的人工模拟肠液中，活菌数呈现明显下降趋势，6 h后活菌数下降了6个数量级。可见，恶味乳杆菌B2对人工模拟胃液具有较好的耐受性，但对人工模拟肠液的耐受性一般。

2.3 恶味乳杆菌B2的降胆固醇能力

2.3.1 胆固醇标准曲线 以胆固醇浓度为横坐标，对应吸光度（D560 nm）为纵坐标，取3次测量的平均值绘制标准曲线，结果见图5，标准曲线回归方程为y=0.000 9x-0.002 8，r2=0994。

2.3.2 体外降胆固醇能力 根据胆固醇标准曲线，计算恶味乳杆菌B2在MRS-CHOL培养基中培养24 h后上清液以及沉淀洗涤液中的胆固醇含量。从表1可以看出，恶味乳杆菌B2培养24 h后对胆固醇的脱除率达到40.24%，具有较好的体外降胆固醇能力。但沉淀洗涤液中胆固醇含量较低，表明大量的胆固醇可能被乳酸菌转运至菌株体内，说明该菌株对胆固醇的清除能力主要依靠的是菌体吸收作用[13-14]。

2.4 恶味乳杆菌B2的耐药性

恶味乳杆菌B2的耐药性评价结果见表2。10种抗生素对恶味乳杆菌B2的的抑菌圈直径均≥15 mm，抑菌效果比较明显，因此认为恶味乳杆菌B2不具有耐药性。此外，质粒提取试验结果显示，恶味乳杆菌B2不含有质粒，因此该菌株不携带耐药基因。

2.5 恶味乳杆菌B2的有害代谢产物

色氨酸是人体必需氨基酸，如果菌株分解色氨酸生成吲哚，会引起人体代谢的紊乱。硝酸盐还原酶可将硝酸盐还原成亚硝酸盐，人体摄入过多亚硝酸盐易引起中毒，同时在胃酸的条件下，亚硝酸盐易与胺类物质反应生成强致癌物亚硝胺。氨基脱羧酶可以将氨基酸转化为生物胺，若菌株含有氨基脱羧酶，则可以将L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸分别转化为腐胺、精胺、亚精胺、尸胺。过量的生物胺会使人出现恶心、腹痛等食物中毒症状[8，15]。由表3可知，恶味乳杆菌B2不产生吲哚，无硝酸盐还原酶活性，因此不能还原硝酸盐生成亚硝酸盐。同时，恶味乳杆菌B2无氨基脱羧酶活性，不能以

3 讨论与结论

研究结果显示，恶味乳杆菌B2的β-葡萄糖苷酶活性较高，因此可降解银杏花粉黄酮苷中的β-葡萄糖苷键，释放出主要黄酮苷元山奈酚。β-葡萄糖苷酶的活性测定为恶味乳杆菌B2生物转化银杏花粉黄酮苷的机制研究提供依据。益生特性研究结果表明，恶味乳杆菌B2具有良好的体外脱除胆固醇能力，对酸和人工模拟胃液的耐受性较好，而对胆盐和人工模拟肠液的耐受性一般，说明恶味乳杆菌B2可能具有良好的通过胃的能力，但在小肠中的存活性一般。总体来说，恶味乳酸菌B2拥有一定的消化道通过能力，可在消化道存活并行使生理功能。安全性研究结果显示，该菌对10种常见抗生素不具有耐药性，并且不携带耐药基因，同时不具备硝酸盐还原酶活性和氨基脱羧酶，不生成亚硝酸盐、亚硝胺、腐胺、精胺和亚精胺、尸胺等有害成分，不分解色氨酸生成吲哚，安全性较高。

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