李宪刚 刘尧 于远洋 张静娇 周凌

摘 要：目的：研究摸索HPLC测定喘嗽宁片中甘草酸（按甘草酸铵折算）含量的方法，并测定3批次喘嗽宁片中甘草酸的含量。方法：采用高效液相色谱法，Thermo SCIENTIFIC C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱，流动相系统以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～8 min，19%A；8～30 min，19%A→50%A；30min，50%A），流速1.0 mL/min；检测波长250nm。结果：甘草酸铵与相邻组分分离度良好，甘草酸铵线性范围为0.1209～2.4173 μg（r=0.9999），线性关系良好，平均加样回收率（n=6）为96.7%，RSD小于2.0%。结论：本文研究确定的方法符合检验方法验证要求，可用于喘嗽宁片中甘草酸含量的质量控制。

关键词：喘嗽宁片；HPLC；甘草酸铵

中图分类号：R927.2 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2019）15-0198-02

0 引言

喘嗽宁片具有清热平喘，止咳化痰功效。用于治疗支气管哮喘，喘息型支气管炎，肺气肿，早期肺心病等疾病。该中药复方制剂由白果、苦杏仁、地龙、桑白皮、陈皮、黄芩、白前、苦参、甘草、茯苓10味药材组成，加水煎煮，收集稠膏，压片而制成。现有质量标准收载于卫生部部颁标准：中药成方制剂第十九册[1]（编号：WS3-B-3696-98），目前，标准中尚无处方组分有效成分含量测定的控制项目。鉴于该品种处分组分比较复杂，标准制定年代久远，因此建立准确、简便的质量分析方法至关重要。处方中甘草有解毒、祛痰、止痛、解痉以至抗癌等药理作用，本文查阅相关文献，建立HPLC梯度洗脱法对制剂中甘草酸[2-5]（以甘草酸铵为测定物质，经折算得出甘草酸含量）活性成分进行检测，完善了本品的质量控制体系[6-7]。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪。Waters e2695并配备有waters2998二极管阵列检测器（DAD）、电子分析天平Sartorius BP211D②型。检测用乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯，提取用乙醇为分析纯，实验用水为超纯水。

对照品甘草酸铵（批号：110731-201619）购入自中检院。收集已有产品上市的三个厂家各1批成品，包含薄膜衣0.6g/片，糖衣片、薄膜衣片0.35g/片三种规格。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

（1）对照品溶液。取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液。（2）供试品溶液。取供试品20片，除去包衣，精密称定，研细，取约1.0g，精密称定，加70%乙醇100，加热回流30min，放冷，再次称定重量，用70%乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。（3）阴性样品溶液。按喘嗽宁片的制备工艺，制成不含甘草药材的阴性样品。按上述供试品制备方法制备阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

甘草酸铵HPLC色谱图1所示，选用Thermo SCIENTIFIC（4.6×250mm，5μm）色谱柱；流动相系统为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8分钟，19%A；8～30 min分钟，19%A→50%A；30分钟之后，50%A）；流速为1.0 mL/min；柱温为30摄氏度；检测波长为250 nm。分别取对照品、供试品及阴性对照溶液各10μL，通过液相色谱仪进行检测，理论板数以甘草酸铵峰计应不低于5000。

3 方法学考察

3.1 专属性试验

精密吸取对照品、供试品及阴性样品溶液各10μL，按上述的色谱条件进行检测并记录液相谱图（见图1）。阴性样品的色谱图中，与对照品谱图保留时间相同的位置未见干扰的色谱峰，结果表明方法专属性良好，阴性无干扰。

3.2 线性关系考察

精密称取甘草酸铵对照品（批号110731-201619纯度：93.0%）10.83mg，置25ml量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液3ml置10ml容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，分别取样1ml、2ml、4ml、8ml、10置10ml容量瓶中加70%乙醇稀释至刻度，精密量取对照品储备液3ml置5ml容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，分别吸取上述溶液10μl测定峰面积，结果表明甘草酸铵的进样量在0.1209～2.4173μg范围内与峰面积呈良好线性关系，以对照品的浓度为X轴横坐标，测得的峰面积为Y轴纵坐标，得到标准曲线，回归方程为：y=738343x-9267.8，r=0.9999。

3.3 精密度试验

仪器精密度：取上述制备方法制备的同一份对供试品溶液，同一仪器连续进样6次，每次进样量10μL，测定峰面积，计算各6次甘草酸铵峰面积值的RSD为0.9%。

3.4 稳定性试验

取供试品溶液同一批，在室温条件下存放0h，2h，4h，8h，12h，24h的条件下进样10μL，按甘草酸铵峰面积计算，RSD为1.1%，表明供试品溶液24h存放期内基本稳定。

3.5 重复性试验

取相同批号的喘嗽宁片（0.6g/片）样品，分别按上述供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件分别进样10μL，测定，6份样品中的甘草酸铵含量RSD为1.1%，表明该方法的重复性良好。

3.6 加样回收率试验

精密称取同一批样品（已知含甘草酸铵1.64mg/g）6份各1.0g，分别精密加入对照品称重10.83mg、10.80mg所制备的对照品储备溶液4mL，按方法制备供试溶液，测定，计算加样回收率，详细见表1。

3.7 样品测定

取收集的喘嗽宁片3批，按上述供试品制备方法的制得供试品溶液进行测定并依照外标法计算成品甘草酸铵含量，结果见表2。

4 讨论

4.1 检定波长选择

本方法采用HPLC-DAD方法在200～400nm范围内对被测组分进行扫描并进行色谱峰纯度检测，结果表明，甘草酸铵在250 nm处有最大吸收且色谱峰纯度良好，故本实验的测测波长确定为紫外光250nm。

4.2 提取溶剂选用、提取方式考察

鉴于甘草药材煎煮入药，借鉴《中国药典》（2015年版）甘草品种含量测定项下的制备方法，通过对50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇不同浓度提取溶剂的提取效力考察，比较了回流和超声两种提取方式及不同提取时间，依据实验结果，确定加以70%乙醇加热回流30min的方式作为本实验供试品的提取制备方法。

4.3 结语

通过实验确定的甘草酸铵的提取时间、提取溶剂、检测波长、色谱柱类型、流动相条件，并进行了检验方法学的研究，该方法准确、快速、简便，结果稳定可靠，可有效对喘嗽宁片处方甘草药材中活性成分进行质量控制，为加强中药复方制剂监管，进一步提高质量标准提供参考。

参考文献

[1] 原卫生部.卫生部药品标准[S].中药成方制剂第十九册，1992.

[2] 郭琪，程利娟，雷虹，等.高效液相色谱法测定甘草远志合剂中甘草酸铵的含量[J].解放军医药杂志，2013（11）：76-78.

[3] 李娟，贺竞敏，张苏，等.两种甘草酸含量测定方法对复方甘草片生产质量的影响[J].现代医药卫生，2012（18）：2820-2822.

[4] 李聪.两个版本《中国药典》的HPLC法检测甘草浸膏中甘草酸含量的比较分析[J].新疆中医药，2011（6）：44-46.

[5] 叶花，王嘉琛，刘培，等.甘草在不同配伍中及炮制前后甘草酸的含量变化研究[J].广州化工，2018（9）：61-65.

[6] 南京中醫药大学.中药大辞典[M].上海：上海科技出版社，2006.

[7] 肖培根.新编中药志（第五卷）[M].北京：化学工业出版社，2007.