吴晓宗，王 岩

（1.郑州大学化工与能源学院，河南 郑州 450000；2.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南 郑州 450002）

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia Solanacearum）引起的土传病害，它的发生不仅与高温高湿的气候有关，还与土壤种类、土壤养分、连作情况、移栽时期、田间管理等有关，难以有效防治［1-3］。近年来，人们选育出对病原菌具有拮抗效果的微生物制成生物有机肥，用来防治土传病害，不仅能增加土壤中有益微生物数量，增强烟株抗病性，还能改善根际微生态环境，促进根系生长和对养分的吸收，在防病的同时还可以改善和修复土壤生态环境，减少化肥和农药的使用，突破了传统有机肥的肥料效果，受到了广泛的重视［4-5］。

土壤微生物多样性用于表征土壤微生物群落结构的变异、相互作用、营养水平和组成数量变化，能较早地反映土壤生态的变化过程，通过调控土壤微生物群落以及改变土壤微生物功能多样性可以抑制作物病虫害［6-7］。近年来发展起来的宏基因组学利用分子生物学的研究方法绕过传统的培养方法来研究微生物的多样性及功能，为土壤微生物研究开辟了新的道路［8-9］。

实验室已从福建省邵武市青枯病发病严重的原位土壤中筛选出拮抗菌［10］，并利用该拮抗菌制成生物肥［11］。本研究考查了该生物肥施用后对烟草青枯病的防治效果，利用高通量宏基因组测序法研究土壤微生物多样性特征差异，揭示生物肥对土壤微生物多样性影响以及和防治青枯病之间的内在关系，为生物防治烟草青枯病提供进一步的思路。

1 材料与方法

1.1 试验设计

2014年3月至8月在邵武市徐溪村青枯病常发烟田进行试验，该地块于2012、2013年连续两年青枯病发病非常严重。试验共设置2个处理，采用完全随机区组设计，重复3次，共6个小区，小区面积固定为132 m2，设有保护行，烟株种植密度为16 500株/hm2，行间距为0.5 m×1.2 m。

在植烟移苗前进行施肥，采用分层施肥的方法，烟叶专用肥与化肥施用量折算为纯氮用量136.35kg/hm2，N∶P∶K 为 1∶0.8∶2.7。邵武烟草公司提供有机肥，有机肥为秸秆堆肥（秸秆与动物粪便混合比例为8∶2）。郑州大学提供拮抗菌剂，其有效菌为蜡状芽孢杆菌 QJ-1（No.M2012271）［10］，向已降至40℃以下的秸秆堆肥中接入拮抗菌，接种量为108cfu/g（干基），生产生物有机肥。其它大田管理措施按邵武市优质烟生产技术规程进行。处理设置如下:

T1处理:常规施肥（施烟叶专用肥+化肥+有机肥，对照）；

T2处理:施生物有机肥（施烟叶专用肥+化肥+生物有机肥，烟叶专用肥、化肥的施用量同常规施肥，生物有机肥施用量按常规施肥施用的有机肥量所生产的生物有机肥量进行）。

1.2 试验方法

土壤取样方法:采用五点取样法取根际土样［12］，样品编号见表1。

表1 土壤样品分类与编号

土壤微生物多样性测定:利用OMEGA试剂盒提取土壤DNA。送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序和多样性分析。

1.3 数据分析与试验观测

采用SPSS 19.0对试验数据进行分析处理。依据《烟草病虫害分级及调查方法》（GB/T 23222-2008）记载青枯病发生病情级数，以株为单位分组调查病害严重程度，病情指数计算如下:

2 结果与分析

2.1 生物有机肥对烟株青枯病防治的效果

本试验所用的生物有机肥对烟草青枯病的抑制作用较为明显，在以往发病严重的烟田中施入后，青枯病的发生情况显著减轻，通过田间试验观测，青枯病从烟株移栽83 d时开始出现，青枯病病情指数如图1所示。在烟株移栽85、95、105 d的3次观察期内，T2的病情指数均低于T1，尤其在移栽后95 d时，青枯病病情指数下降了31.43%，说明施用生物肥可以有效抑制烟草青枯病的发生，降低病情指数，提高防控效果。

图1 两种处理对烟株青枯病发病的影响

2.2 生物有机肥对土壤细菌群落结构的影响

2.2.1 土壤细菌群落多样性分析

7个样本的土壤细菌多样性指数如表2所示，Coverage表示测序获得的序列占整个基因组的比例。Shannon指数反映细菌群落的变化度或差异度，受样本总数和均匀度的影响，数值越大，表明土壤中微生物多样性越高［6-8］。ACE指数反映物种丰富度，值越大，表明群落中含有的OTU（Operational taxonomic units）数目越多，群落丰富度越高。

表2 不同土壤细菌多样性指数

各样本的Coverage值均高于0.7，表明测序获得的序列覆盖程度较高，具有较好的代表性。这反映出本试验构建的克隆文库能比较真实代表该地区土壤细菌的多样性。T2处理的Shannon指数均比同期T1处理的要大，说明生物肥的添加提高了土壤中细菌的多样性。T1与T2处理中发病烟株土壤细菌的Shannon指数均大于健康烟株土壤和发病前烟株土壤，说明青枯病的发病与土壤细菌多样性有一定关系。发病后T1B 的ACE指数比发病前T1W增加了12.05%，丰富度指数提高不明显。而T2B的ACE指数比T2W增加了42.67%，说明生物肥的添加对青枯病发病时烟株土壤细菌种群丰富度影响较大。

2.2.2 生物有机肥对土壤细菌群落结构的影响

对7个样本土壤细菌群落的组成在科与属水平上进行了相对丰度的比较。从表3中可以看出，在科水平上，烟株移栽前TY样本的土壤草酸杆菌科Oxalobacteraceae、芽孢杆菌科Bacillaceae、梭菌科Clostridiaceae相对丰度明显高于烟株移栽后各样本。T1W、T2W与T1C、T2C细菌群落丰度相差不大，与T1B、 T2B相比差距明显，比如鞘脂单胞菌科Sphingomonadaceae、间孢囊菌科Intrasporangiaceae在烟株发病的土壤中含量较低，说明在科水平上，移栽后70 d的烟株发病前土壤样本与移栽后90 d的健康烟株土壤样本细菌群落相似，而移栽后90 d的发病烟株土壤样本细菌群落则差别较大，这与青枯病的发病密切相关。

表3 科水平各土壤样本细菌群落的相对丰度 （%）

由图2可知，在属水平上，TY细菌种类最少，群落结构相对简单，未分类细菌和其他类细菌的含量也较低，已分类细菌中Massilia含量最高，为优势菌。T1C、T2C、T1B、T2B未分类细菌的相对丰度逐渐上升，说明未分类细菌中种类和数量在增加；而已分类细菌种类相似，优势菌都为:酸杆菌Gp1（Acidobacteria_Gp1）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、酸杆菌Gp3（Acidobacteria_Gp3）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium），但相对丰度差异较大。

图2 属水平各土壤样本细菌群落结构比较

在对T1C、T1B和T2C、T2B比较后发现，发病烟株根际土壤区系中节杆菌属（Arthrobacter）均未出现，而在未发病烟株根际土壤中，却有着一定的相对丰度，可能与烟草青枯病发病相关。

2.2.3 不同样本细菌群落主成分分析

对7个样本进行细菌组成的主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），提取两个主成分因子，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）是造成4个样品的两个最大差异特征，分别可以解释为所有变量的56.4%和20.2%，两个主成分累加方差贡献率达到76.6%，可以表征大多数的标量特征。因此，取两个主成分（PC1和PC2）作图来表示细菌群落的特征，见图3。

从 图3可 以 看 出， 相 比TY，T1W、T2W、T1C、T2C、T1B、T2B 中的细菌群落结构均发生了较大改变。在第一主成分上，TY与T1B处理土壤细菌群落组成基本一致，与T1W、T2W处理存在较大差异。在第二主成分上，TY、T1W、T2W、T1C和T2C处理间的土壤细菌群落组成具有一致性，PC2的贡献率大于PC1的贡献率，可以认为生物肥是影响土壤细菌群落组成的主要因素。

图3 不同样本细菌群落PCA分析

2.3 生物有机肥对土壤真菌群落结构的影响

2.3.1 土壤真菌群落多样性分析

7个样本的土壤真菌多样性指数如表4所示，7个样本的Coverage值均高于0.8，表明测序获得的序列覆盖程度较高，反映出本试验构建的克隆文库能比较真实代表该地区土壤真菌的多样性。TY土壤中的OTU数目最高，T2C土壤中OTU数目大于T2W，且两者均远大于T1B，说明生物肥的添加能增加土壤中真菌的多样性，而T2处理下的发病土壤中Shannon指数要高于健康状态下的，说明烟草青枯病的发生与土壤中真菌多样性有关。发病后与发病前的ACE指数变化不大，说明施肥对土壤的真菌丰富度影响不大。

表4 不同样本的土壤真菌多样性指数

2.3.2 生物肥对土壤真菌群落结构的影响

对7个样本的土壤真菌群落的组成在科水平上进行了相对丰度的比较，结果如表5所示。TY处理的土壤中被孢霉科Mortierellaceae含量最高，T2C处理的土壤除了被孢霉科Mortierellaceae增加外，其余的都有不同程度的降低，说明生物肥有利于该菌的生长，是土壤中的优势菌。T2B处理的土壤中被孢霉科Mortierellaceae和丛赤壳科Nectriaceae的含量分别降低了76.1%、92.3%，而粪盘菌科Ascobolaceae的含量增加了64.9%，说明青枯病的发生与这3种菌科的含量变化有一定的关系。

表5 科水平各土壤样本真菌群落的相对丰度 （%）

由图4可以看出，在属水平上，TY真菌种类最少，群落结构相对简单，未分类真菌和其他类真菌的含量也较低，已分类真菌中被孢霉属Mortierella含量最高，为优势菌。T1C、T2C、T1B、T2B未分类真菌的相对丰度逐渐上升，说明未分类真菌中种类和数量在增加；已分类真菌种类存在一定的差异，T1C优势菌为:被孢霉属（Mortierella）、BG01－7、粪盘菌属（Ascobolus）、暗壳腔菌属（Phaeosphaeria），T2C的优势菌为:被孢霉属（Mortierella）、丛赤壳属（Nectria），T1B的优势菌为:被孢霉属（Mortierella）、丛赤壳属（Nectria）、Lulwoana，T2B优势菌为:BG01－7、被孢霉属（Mortierella）、粪盘菌属（Ascobolus）、酵母属（Saccharomyces），并且相对丰度存在一定的差异。

在对T1C、T1B和T2C、T2B比较后发现，发病烟株根际土壤区系中田头菇属（Agrocybe）均未出现，而在未发病烟株根际土壤中，却有一定的相对丰度，可能与烟草青枯病发病相关。

2.3.3 不同样本真菌群落主成分分析

对7个样本进行真菌组成的主成分分析，提取两个主成分因子，分别可以解释所有变量的42.7%和26.1%，两个主成分累加方差贡献率达到68.8%。从图5可以看出，在第一主成分上，T2W与TY距离较远，土壤中的真菌菌落存在较大差异，说明生物肥是影响土壤真菌群落组成的主要因素。在第二主成分上，TY与T2W处理间的土壤真菌群落组成

具有一致性，而T2C与T2B距离较远，说明生物肥是影响土壤真菌群落组成的主要因素。

3 讨论与结论

众多研究表明，采用拮抗菌制成生物有机肥施用来防治植物病害具有良好的效果［13-14］，生物肥不仅满足了植物的生长需要，还为拮抗菌提供了足够的营养物质，使其在根际土壤微生物区系中更易成为优势菌［15］。本研究中微生物有机肥的施用可以显著降低烟草青枯病的病情指数，与王丽丽等［16］和陈巧玲等［17］的研究结果一致。生物肥的施用不仅抑制了烟草青枯病的发生，更促进了烟叶的生长和上等烟叶的比例，整体上提高了烟叶的经济性状。

高通量宏基因组测序从土壤样本中直接提取微生物DNA，避免了传统分离培养法会遗漏土壤中绝大多数微生物的缺点，较为真实地反映了土壤微生物群落的丰度及其作用机制。T2发病株与健康株的香农系数均比T1对应处理要高，说明生物肥的加入提高了烟株根际土壤细菌的多样性［18］。而发病株根际细菌数量高于未发病株，可能是因为青枯病菌在侵入寄主过程中或在侵入后，一定程度上干扰植物的正常代谢，而烟株为了抵抗这种变化，通过改变根系分泌物或内生细菌来进行调节，从而造成根际微生物区系微生物种类增加，说明发病株青枯病菌诱导了根际环境发生变化。存在于发病株和健康株根际土壤中的细菌属类大部分相同，尤其是优势菌都一样，但相对丰度有差异。对于T1处理，发病株与健康株优势菌相对丰度差异较大，而施用生物肥的T2处理，发病株与健康株优势菌相对丰度差异不大，说明拮抗菌的加入，使得青枯病菌数量减少，或者说烟株更易于应对青枯病菌的侵扰，因而根际土壤微生物区系优势菌变化不大。在对T1C、T1B和T2C、T2B比较后发现，发病烟株根际土壤区系中节杆菌属（Arthrobacter）均未出现，而在健康烟株根际土壤中，却有着一定的相对丰度，可能与烟草青枯病发病有关。

图4 属水平各土壤样本真菌群落结构比较

图5 不同样本真菌群落PCA分析