施河丽，向必坤，彭五星，尹忠春，罗 芳，谭 军

（湖北省烟草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000）

在烟草种植过程中大部分烟区都存在长期连作，化学肥料大量使用，化学农药和除草剂滥用，植烟土壤微生态失衡等问题，使得烟株生长发育受阻，烟叶品质下降，烟草土传病害加重等现象日益凸显。施肥是影响土壤质量和可持续发展的重要措施之一［1］。但由于肥料种类的不同，施肥对土壤质量的影响也存在较大差异，如一些研究发现长期施用化学肥料会导致土壤质量下降［2-3］；有机肥、无机有机肥配施能提升土壤质量［4-5］。施用的肥料可以通过影响土壤化学成分引起土壤微生物活性、土壤微生物群落结构改变，也可以通过改变土壤的物理性状影响地上植被的生长状况，从而间接地影响土壤微生物群落结构。近年来施肥对土壤酶活性、微生物量碳氮、微生物多样性和微生物活性等的影响方面引起了研究人员的广泛关注。Kamaa等［6］试验发现有机肥或有机无机混施能明显影响土壤微生物群落结构。于冰等［7］在湖南祁阳的长期定位试验研究发现，施用有机肥不但可以缓解化肥引起的土壤酸化，还能支持更大、更丰富的微生物群体。袁红朝等［8］研究了同地带的水稻土不同施肥下的微生物群落变化，提出化肥配施有机物料可显著增加土壤细菌种群多样性和数量。Yu等［9］在淋溶土地上的施肥研究发现，无机肥的施用抑制微生物生长，有机肥的施用促进微生物生长。由此可知，有机肥、无机有机肥配施对土壤微生物表现为促进作用。

前人利用Illumina Miseq高通量测序平台探讨了施肥对土壤中微生物群落多样性和结构组成的影响［10-11］。然而，对比研究有机无机肥料配施培肥土壤的特征及优势，尤其是施用不同有机肥影响了哪些关键菌群，进而调控了土壤养分循环，值得进行深入探索。本文通过3年定位试验，研究了施用不同有机肥对土壤理化性质和微生物群落结构的影响，为优化恩施烟区施肥制度，提高土壤肥力，维护烟田土壤微生态系统等方面提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

于2015～2017年连续在湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩县椒园镇水井坳村（北纬29°96′，东经109°37′，海拔1 080 m）设置田间试验。试验区属中亚热带季风湿润型山地气候，年均气温13.7℃，无霜期263 d，年降水量1 635.3 mm，年日照时数1 212.4 h。土壤类型为恩施烟区具有代表性的山地黄棕壤，土壤质地为壤土。试验开始前耕层（0～20 cm）土壤的基本理化性质:土壤pH值 6.2（水土比 2.5∶1），有机质 32.17 g·kg-1，碱解氮 146.57 mg·kg-1，有效磷 33.61 mg·kg-1，速效钾275.00 mg·kg-1。供试作物为烤烟，品种为云烟87。

试验处理分别为常规化肥（CF）、烟草秸秆生物有机肥（TBF）+化肥、高碳基土壤修复肥（HCF）+化肥。施氮量均为97.5kg·hm-2，试验中氮磷钾肥料配比为 N∶P2O5∶K2O=1∶2∶3，所有处理在等量NPK养分的基础上进行，有机肥不足的NPK由化肥提供，化肥种类有烟草专用复合肥（8-12-24）、过磷酸钙（0-12-0）、硝铵磷肥（30-6-0）、硫酸钾（0-0-50）。烟草秸秆生物有机肥和高碳基土壤修复肥全部用作基肥条施，其它试验操作按照《恩施州烟草公司烤烟生产技术指导方案》的常规方法进行。烟草秸秆生物有机肥（TBF），其有机质（干基）≥45%、含氮（N）量为1%、含磷（P2O5）量为1.5%、含钾（K2O）量为2.5%、有效活菌数（cfu）≥0.20亿·g-1、pH值8.2；高碳基土壤修复肥（HCF），其有机质（干基）≥45%、含氮（N）量为2%、含磷（P2O5）量为2%、含钾（K2O）量为2%、生物炭≥20%、pH值7.4。试验设2次重复，随机区组排列，小区面积40 m2，每小区植烟60株。

表1 不同施肥处理肥料投入量 （kg·hm-2）

1.2 样品采集

于2017年9月中旬，烟叶采收结束后，按S型五点采样法分小区采集耕层（0～20 cm）土壤，混合均匀后用冷藏箱保存土样，带回实验室。将土壤样品去除烤烟根系残体和杂物后分为两份，一份冻存于-20℃冰箱中，用于土壤微生物分析；另一份自然风干后，用于测定土壤基本理化性质。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤理化性质测定

各指标的测定参照《土壤农业化学分析方法》［12］。土壤pH值采用电位法测定（水土比2.5∶1）；土壤有机质（SOM）采用重铬酸钾容量法测定；土壤碱解氮（AN）采用扩散法测定；土壤有效磷（AP）采用硫酸钼锑抗比色法测定；土壤速效钾（AK）采用火焰光度法测定。

1.3.2 土壤微生物总DNA提取和PCR扩增

扩增细菌16S rRNA基因V3-V4可变区，采用正向引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAG CA-3’），反向引物 806R（5’-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3’）。PCR反应体系为:土壤微生物DNA模板（10 ng·μL-1）2.5μL，Forward引物和Reverse引物（1.0 μ mol·L-1） 各 5.0μL，KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5μL。PCR扩增条件为: 95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，25个循环；72℃延伸5 min。PCR产物经纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库进行文库纯化、质检后，送上海伯豪生物技术有限公司，采用MiSeq sequencer进行测序。

1.3.3 生物信息学分析流程

采用Mothur软件将测序序列去重复，与已知数据库GreenGene、Silva等比对，去除嵌合体序列和线粒体、叶绿体序列。将优化序列进行物种注释并聚类得到OTU（Operational Taxonomic Units），根据OTU的序列组成得到其物种分类。基于OTU聚类分析结果，对样品的多样性及组间差异进行分析，并结合物种分类信息，在各个分类水平上进行分类学分析。生物信息学高级分析由上海伯豪生物技术有限公司协助完成。

1.4 数据分析

利用R语言的VennDiagram包绘制Venn图；利用Mothur软件分别进行α多样性指数计算和聚类分析；土壤理化性质、细菌OTU数、α多样性指数、物种组成及相对丰度等数据利用Excel 2007进行初处理和制图，多重比较、方差分析和Spearman相关性分析用SPSS 22.0 软件完成；细菌群落结构的主成分分析（Principal Component Analysis， PCA）和典范对应分析（Canonical Correspondence Analysis，CCA）用R语言工具完成。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理土壤理化性质

由表2可知，HCF处理的土壤碱解氮（AN）含量最低，且显著低于CF和TBF处理。HCF处理的pH值、有机质（SOM）、有效磷（AP）和速效钾（AK）含量有高于CF和TBF处理的趋势，但无显著差异。与CF处理相比，HCF处理SOM、AP和AK含量分别增加了2.63%、8.39%和12.51%，而AN含量显著降低了34.09%；TBF处理AP和AK含量分别增加了5.78%和11.87%，而SOM和AN含量分别降低了4.54%和0.57%。

表2 不同施肥处理土壤理化性质

2.2 不同施肥处理土壤细菌OTU数和α多样性

在97%相似水平下，得到不同施肥处理土壤样品中细菌OTU数为5 884～6 458（表3），大小依次为TBF＜HCF＜CF，CF处理土壤细菌OTU数有高于TBF和HCF两个处理的趋势。Chao指数可以反映微生物群落物种丰富度，其值越大表明微生物群落丰富度越高；香浓指数和辛普森指数可以反映微生物群落物种多样性，其值越大表明微生物群落多样性越高。由表3可知，HCF处理土壤细菌Chao指数、香浓指数和辛普森指数均最高，TBF处理次之，CF处理最小；TBF和HCF处理土壤细菌Chao指数、香浓指数和辛普森指数有高于CF处理的趋势。α多样性分析结果表明，施用烟草秸秆生物有机肥和高碳基土壤修复肥有提高土壤细菌多样性的趋势。

表3 不同施肥处理土壤细菌多样性指数

2.3 不同施肥处理土壤细菌OTUs分布

Venn图能够反映样品之间共有和特有的OTU数目，可以比较直观地表现样品之间的OTU组成相似程度。各处理土壤样品一共有18 517个细菌OTU（图1），共有的细菌OTUs数量为3 272个，只占OTU总数的16.67%，说明施用烟草秸秆生物有机肥和高碳土壤修复肥对细菌OTU丰度的影响明显。CF和TBF样品共有1 360个细菌OTUs，CF和HCF样品共有835个细菌OTUs，TBF和HCF样品共有3 448个细菌OTUs，TBF和HCF样品共有的OUT数目最高，说明不同有机肥处理间的细菌类群组成相似性＞化肥处理与有机肥处理间的细菌类群组成相似性。CF、TBF和HCF样品特有的OTUs数量为896～3 213，大小依次为TBF＜HCF＜CF，CF样品中特有的OTUs数量最多，而施用烟草秸秆生物有机肥和高碳基土壤修复肥分别使土壤特有细菌种类下降了72.11%和70.12%。

图1 不同施肥处理土壤细菌Venn图

2.4 不同施肥处理土壤细菌群落组成

2.4.1 门水平上的细菌群落组成

在门水平上，CF、TBF和HCF处理分别获得33、30和31个类群。将相对丰度＜1%的类群归类为其他，得到12个类群。由图2可知，有4个主要的细菌种群占所有序列的多数（80.59%～83.31%），其中，绿弯菌门（Chloroflexi）占17.53%～27.17%，放线菌门（Actinobacteria）占24.37%～32.92%，变形菌门（Proteobacteria）占21.55%～26.90%，酸杆菌门（Acidobacteria）占7.50%～9.27%；CF处理中绿弯菌门（Chloroflexi）相对丰度最高，TBF和HCF处理中放线菌门（Actinobacteria）相对丰度最高。进一步分析处理间差异发现，TBF和HCF处理绿弯菌门（Chloroflexi）、Saccharibacteria、厚壁菌门（Firmicutes）、WD272和蓝细菌门（Cyanobacteria）的相对丰度分别比CF处理降低了31.41%和35.47%、69.26%和53.66%、4.28%和40.84%、88.70%和97.61%、62.94%和75.35%；而TBF和HCF处理放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和浮霉菌门（Planctomycetes）的相对丰度分别比CF处理提高了35.08%和25.41%、4.33%和24.87%、23.50%和1.58%、34.40%和64.74%、40.55%和73.16%、115.49%和62.80%。

图2 不同施肥处理细菌门水平组成（相对丰度＞1%）

2.4.2 属水平上的细菌群落组成

从属的分类水平来看（表4），不同施肥处理间具有显著差异的细菌属有16个。与CF处理相比，TBF处理显著增加了节杆菌属（Arthrobacter）、贪噬菌属（Variovorax）的相对丰度；HCF处理显著增加了Chthonomonas、厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）的相对丰度，显著降低了狭义梭菌属8（Clostridium sensu stricto8）、海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）的相对丰度；TBF和HCF处理显著增加了Patulibacter、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、农研丝杆菌属（Niastella）、Rice ClusterI的相对丰度，显著降低了Nicotiana otophora、Perlucidibaca、Fonticella、中华单胞菌属（Sinomonas）的相对丰度。枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）是HCF处理中特有的细菌属。

表4 不同施肥处理间相对丰度显著差异的细菌属 （%）

2.5 细菌群落组成的PCA聚类分析及丰度UPGMA聚类分析

主成分分析（PCA）表明（图3），第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的贡献率分别为36.37%和19.71%，累计贡献率达到56.08%，说明PC1和PC2是变异的主要来源，可以解释变量的绝大部分信息。6个样品点在PC轴上分布有差异，CF样品点在PCA图中的距离较近，聚在一起，并且与TBF和HCF处理样品点相距较远。UPGMA聚类分析表明（图4），施用有机肥处理（TBF1、TBF2、HCF1和HCF2）的各菌群丰度与施用化肥处理（CF1和CF2）的各菌群丰度被聚类为2个分支，说明施用有机肥后各菌群丰度发生了明显变化；CF1和CF2、HCF1和HCF2样品间相似性较高。

图3 细菌群落的主成分分析

图4 门水平上的细菌相对丰度聚类树

2.6 不同施肥处理土壤细菌群落结构与土壤理化性质的关系

由表5可知，相对丰度差异显著细菌属与土壤部分理化指标表现出显著的相关关系，其中赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、Oceanobacillus、Fonticella均与土壤碱解氮含量呈显著正相关关系，而Anoxybacillus、Virgibacillus与土壤碱解氮含量呈显著负相关关系；Patulibacter、Rice ClusterI与土壤速效钾含量呈显著正相关关系，而狭义梭菌属8（Clostridium sensu stricto8）、中华单细胞菌属（Sinomonas）与土壤速效钾含量呈显著负相关关系。

表5 相对丰度差异显著细菌属与土壤理化性质之间的相关关系

为进一步分析不同土壤理化性质对细菌群落结构的影响，对细菌群落结构与土壤理化性质进行典范对应分析（CCA）（图5）。结果显示，前两个排序轴总共解释了86.81%的细菌群落变化，第一排序轴（CCA1）解释了74.49%，第二排序轴（CCA2）解释了12.32%，其中第一排序轴（CCA1）对土壤细菌群落变化解释最多。CF、TBF和HCF处理样品点彼此分离，TBF和HCF处理样品点都分布在纵坐标轴的左侧。AN和AK与横坐标正轴夹角较小，pH值、SOM和AP与横坐标负轴夹角较小，表明这5个指标与CCA1相关性较高。从图中箭头的分布可以看出，pH值、AN和AK这3个指标与土壤细菌的群落结构存在较强的相关性。

图5 土壤细菌群落结构和土壤理化性质的CCA分析

3 讨论

3.1 不同施肥处理对土壤理化性质的影响

有机肥的种类和性质是决定其培肥作用的主要因素。土壤碱解氮是植物能直接吸收利用的生物有效态氮，能反映土壤近期内氮素供应状况，是铵态氮（NH4+-N）、硝态氮（NO3--N）、氨基酸、酰胺和易水解的蛋白质氮的总和［13］。本研究表明，高碳基土壤修复肥处理耕层土壤中碱解氮含量显著下降。这与前人的研究结果不同［14-15］，其中的可能原因主要有:其一，高碳基土壤修复肥与化肥配施条件下，土壤中有机碳含量增加使得土壤碳氮比提高［16］，反而降低了土壤中微生物对有机氮的矿化速率［17］；其二，高碳基土壤修复肥的多孔结构和含氧官能团会吸附和固定土壤和肥料中的NH4+-N，暂时降低土壤氮素的有效性［18］。总体来看，烟草秸秆生物有机肥和高碳基土壤修复肥对土壤速效养分的影响存在差异，施用高碳基土壤修复肥抑制了土壤中氮的有效性。

3.2 不同施肥处理对土壤细菌群落多样性的影响

多样性指数是评价土壤细菌群落多样性的重要指标，多样性指数越高表明土壤细菌群落的丰富度和多样性越高。通过多样性指数评价，本研究中烟草秸秆生物有机肥和高碳基土壤修复肥两个处理细菌群落的Chao、香浓和辛普森指数有高于化肥处理的趋势，说明施用烟草秸秆生物有机肥和高碳基土壤修复肥，在一定程度上有利于提高土壤细菌群落多样性，引起了土壤细菌群落结构的变化。本研究发现，化肥处理烟田土壤细菌OTU总数和独有的细菌OTU数均为最多，说明单施化肥可能会引起某些土壤微生物的富集和一些微生物种类的丧失，这与姚健等［19］、赵兰凤等［20］的研究结果相一致，因此应避免长期施用化肥；烟草秸秆生物有机肥和高碳基土壤修复肥两个处理共有的OTU数最高，说明它们的细菌类群组成较为相似。

3.3 不同施肥处理对土壤细菌群落结构组成的影响

烟田耕层土壤中，绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）等是主要细菌类群，这与前人的研究相印证［21-22］。节杆菌属（Arthrobacter）是所有土壤细菌中最为常见的细菌之一，其在环境的适应生长中，拥有很多不同的功能，如降解烟碱［23-24］、生物除磷［25］、去除重金属［26］等。据报道贪噬菌属可以降解很多化合物，包括腈类除草剂［27］、原油相关的硫代物［28］、烟碱类杀虫剂噻虫啉［29］等。本研究发现节杆菌属（Arthrobacter）和贪噬菌属（Variovorax）在烟草秸秆生物有机肥处理土壤样品中的丰度显著高出化肥处理，推测施用烟草秸秆生物有机肥可能刺激了与烟碱降解相关细菌的生长，其原因有待进一步深入研究。

研究还发现，在属水平上一些对植物生长有益的促生菌和拮抗菌在烟草秸秆生物有机肥和高碳基土壤修复肥处理土壤样品中的丰度显著增加。例如，Patulibacter具有溶磷作用［30］，而溶磷细菌是根际促生菌（PGDR）中重要的一类，可将土壤中难以被植物吸收利用的磷，特别是矿物磷转变为可以被植物吸收的有效磷；短芽孢杆菌属（Brevi－bacillus）具有根际拮抗作用，徐莹莹等［31］研究表明短芽孢杆菌属在烟草根际拮抗菌中所占的比例为9.1%；枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）对烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌、番茄叶霉病菌、番茄灰霉病菌、水稻串珠镰刀病菌和水稻纹枯病菌等多种植物病原菌有明显抑制作用［32］。说明施用烟草秸秆生物有机肥和高碳基土壤修复肥，可能有利于根际促生菌和拮抗菌的生长，从而促进植物根系的生长，抵抗植物病原菌，提高植物应对环境压力。

3.4 不同施肥处理土壤细菌群落结构与土壤理化性质的关系

土壤理化性质如pH值、有机质和土壤养分的改变是影响土壤细菌群落结构的重要因素［33-34］。由表4可知AN和AK与部分差异显著细菌属显著相关。CCA分析结果进一步证明了施用烟草秸秆生物有机肥和高碳基土壤修复肥对土壤细菌群落结构产生了深刻的影响，其中土壤pH值、AN和AK含量是影响土壤细菌群落结构的重要因子，这与许多研究结果类似［35-37］。pH值对微生物适宜生存环境影响巨大；氮是土壤中最为活跃的大量营养元素之一，也是植物需要量较大的营养元素；钾是土壤中常因供应不足而限制作物生长和造成减产及品质下降的主要营养元素之一，土壤钾素的供给主要是有机肥。

4 结论

有机无机肥料配施对植烟土壤的理化性质产生了一定影响，高碳基土壤修复肥配施化肥可显著降低土壤碱解氮含量。有机无机肥料配施有降低土壤细菌OTUs数量的趋势，同时有利于提高土壤细菌群落结构多样性。有机无机肥料配施显著增加了土壤Patulibacter、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、农研丝杆菌属（Niastella）等有益细菌属丰度。有机无机肥料配施培肥改土后，土壤理化指标对细菌群落产生显著影响的因子为pH值、AN和AK。综上，有机无机肥料配施改变了植烟土壤养分状况，调节了植烟土壤细菌群落结构。