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肿瘤免疫中CD4+CD25+CD127low/-调节性T细胞作用研究

2019-08-28吴彬梁华山赵海霞杨睿霞郭亮

中国现代医药杂志 2019年7期
关键词:调节性免疫系统外周血

吴彬 梁华山 赵海霞 杨睿霞 郭亮

肿瘤免疫是指机体免疫系统有效识别、杀伤肿瘤细胞的一系列正常生理过程。当免疫系统识别、激活免疫应答能力降低时,就会出现肿瘤免疫逃逸。调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)是在机体免疫系统中发挥负向调节作用的细胞,拥有免疫无反应性和免疫抑制两大功能[1]。CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞与肿瘤免疫逃逸密切相关,具有抑制CD4+T 细胞和CD8+T 细胞活化、增殖的作用。叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)与免疫调节相关,在细胞的分化和功能维持方面具有重要作用,是Treg 细胞的特异性标记[2]。CD127与Foxp3 在调节性T 细胞表面表达呈负相关,选择CD127low/-作为Treg 细胞标记可排除CD25+的效应性T 细胞,更真实反映Treg 细胞水平[3]。本研究采用流式细胞术检测癌症患者与正常健康人群外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg 比例,同时通过RTPCR 方法检测Foxp3 表达情况,探讨Treg 细胞在肿瘤免疫中的意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月~2017年12月就诊于我院的78 例癌症患者,男45 例,女33 例;年龄39~87 岁,中位年龄51 岁,所有病例均经病理诊断证实,临床分期根据国际抗癌协会标准,其中肺癌33例、胃癌12 例、结直肠癌10 例、乳腺癌8 例、多发性骨髓瘤7 例、非霍奇金氏淋巴瘤6 例,肾癌2 例。其中I~II 期42 例,III 期20 例,IV 期16 例;入选者均未接受其他治疗。对照组68 例,来自健康体检人群,男38 例,女30 例;年龄35~72 岁,中位年龄45 岁。

1.2 主要试剂 FITC (Mouse Anti-Human) CD4 抗体、APC(Mouse Anti-Human)CD25 抗体、PE(Mouse Anti-Human)CD127 抗体、溶血素购自美国BD 公司,PCR 试剂购自德国QIAGEN 公司。

1.3 流式细胞术检测CD4+CD25+CD127low/-Treg EDTA 抗凝管采集受试者空腹静脉血3ml,取100µl全血标本置于流式管中,分别加20µl 抗体,室温避光孵育15min,加入500µl 溶血素避光孵育10min,加入鞘液2ml,1 500r 离心5min,弃上清,加500µl鞘液重悬细胞后上机。

1.4 real-time PCR 检测Foxp3 表达情况 Foxp3上游引物:5'-CAG CAC ATT CCC AGA GTT CCT C-3',下游引物:5'-GCG TGT GAA CCA GTG GTA GAT C-3'。参照说明书进行PCR 操作,反应条件为:94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 60s,共30 个循环。以GAPDH 为内参,计算相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0 软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t 检验法,以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞比例 通过流式细胞术检测外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞的情况,如图1 所示为一个典型特征结果,以前向散射光FSC 及侧向散射光SSC 设门R1 选取淋巴细胞群,去除碎片;在CD4/SSC 图上显示R1 内的细胞,选取CD4+细胞设门R2,在CD127/CD25 图上显示R2 内的细胞,第二象限UL 为CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞占CD4+细胞比例为7.52%。癌症患者与正常对照组相比,外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞比例为(5.89±1.74)%显著高于正常对照组(2.17±0.93)%(t=-16.40,P<0.05)。且不同分期实验组Treg 细胞比例也均显著高于正常对照组(P<0.05),其中III 期、IV 期癌症患者Treg 细胞比例显著高于I~II 期患者(P<0.05),III 期和IV 期癌症患者Treg 细胞比例差异无统计学意义(P=0.26)。见表1。

图1 流式细胞术检测CD4+CD25+CD127low/-Treg

表1 各组外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg/CD4+T细胞比例(%)

2.2 外周血中Foxp3 表达情况 癌症患者与正常对照组相比,外周血中Foxp3 相对表达量为(2.65±0.92)%显著高于正常对照组(1.57±0.47)%(t=-9.06,P<0.05),且不同分期实验组Foxp3 相对表达量也均显著高于正常对照组(P<0.05),其中IV 期癌症患者外周血中Foxp3 表达显著高于I~II 期、III期患者(P<0.05),I~II 期和III 期癌症患者外周血中Foxp3 表达无显著差异(P=0.06)。见表2。

表2 各组外周血中Foxp3 表达情况

3 讨论

在肿瘤入侵的最初阶段,机体免疫系统可以通过免疫细胞及多种机制清除大多数肿瘤细胞,使机体免疫处于平衡状态;在适应免疫系统后,肿瘤细胞通过变异突破免疫系统的限制,逃避免疫系统的攻击。肿瘤发生免疫逃逸的能力是肿瘤发生最相关的基本特征之一。

免疫细胞主要包括固有免疫细胞和适应性免疫细胞,而T 淋巴细胞与B 淋巴细胞即为适应性免疫细胞。T 细胞中的Treg 细胞可以抑制免疫、控制自身免疫反应,在肿瘤微环境中大量存在。Treg 细胞可以通过多种机制抑制T 细胞的活化和增殖。如Treg 细胞可以抑制APC 表面的MHC 分子和共刺激分子(CD80 和CD86),从而减弱APC 向T 细胞的抗原提呈作用;Treg 细胞可以分泌抑制性细胞因子(如TGF-β、IL-10、IL-35)并消耗γc 细胞因子,达到抑制T 细胞的活化和增殖的作用;Treg 细胞分泌穿孔素和颗粒酶对T 细胞和APC 进行杀伤等[4]。

Treg 细胞免疫表型为CD4+CD25+CD127low/-,通过多种机制参与肿瘤免疫调控,在机体免疫系统中发挥负向调节作用,降低了机体对肿瘤细胞的免疫监视和免疫攻击能力,深入研究调节性T 细胞和肿瘤免疫之间的关系有助于进一步揭示肿瘤发生、发展及迁移机制[5]。Foxp3 是Treg 的特异性核转录因子,对Treg 发育和功能维持起着重要的调节作用。Foxp3 基因突变会导致Treg 发育和功能受损,发生免疫调节紊乱[6]。CD127 在具有免疫抑制作用的Treg 细胞中低表达,在混合淋巴细胞培养中可抑制同源激活T 细胞的能力,并在相同刺激下无自身作用[7]。Frederick 等[8]研究发现CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞在乳腺癌患者的肿瘤免疫逃逸中发挥着作用。Erin 等[9]认为Treg 细胞对肺癌患者肿瘤微环境有影响,可抑制CD8+细胞的抗肿瘤能力,并且与环氧化物酶COX2 共同增强肿瘤的血管再生能力及侵袭能力。韩丽芳等[10]研究了肝细胞癌组织浸润Foxp3+调节性T 细胞与肿瘤免疫的关系,发现Foxp3+调节性T 细胞通过抑制CD8+T 细胞增殖,分泌免疫抑制细胞因子IL-10 抑制肝癌的局部免疫,可能导致肿瘤细胞增殖。

本研究对78 例不同癌症患者外周血中的CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞及Foxp3 表达水平的分析证实,Treg 细胞可以较好的评价癌症患者免疫状况。不同癌症患者者外周血中的CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞比例均显著高于健康人群,与国内外研究结果基本一致[11~14]。同时可以看出,不同分期癌症患者Treg 细胞比例有所差异,提示肿瘤疾病的发展与免疫水平的降低有相关性。正常细胞发生恶性突变后,进一步诱导Treg 细胞增多,而Treg 细胞又在肿瘤微环境中发挥免疫抑制作用,这种协同作用可能会导致癌症进一步进展。因此,通过检测外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg 细胞的数量可更好地评价患者的免疫情况,为癌症的诊断与治疗提供科学临床依据。

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