董志红, 陈 渝, 宋慧谨, 周长春, 卢志龙, 李 旭

(1.成都大学 机械工程学院, 四川 成都 610106；2.四川大学 国家生物医学工程研究中心， 四川 成都 610064)

0 引 言

随着材料学、分子生物学和基础医学等交叉学科的发展，通过生物活性材料在体内刺激细胞(干细胞)使其迁移、增殖、分化、诱导，使自身的组织进行再修复以及重建受损组织或器官，已成为该领域研究的热点.20世纪70年代，科研人员就发现了生物玻璃粉体(CaO-SiO2-P2O5)材料，该种材料具有特有的生物活性，可与人体活骨组织产生牢固的化学结合，植入人体后与组织界面区域不会形成非黏连性纤维层隔膜，进一步的研究也证实了生物玻璃作为骨修复材料长期植入体内对成骨细胞没有毒性，能促进成骨细胞的增殖，加速新骨的生成，并和骨形成牢固的键合，可修复受损的骨组织和牙缺损，获得了较好的临床应用效果[1-5].氟是人体中的一种必需微量元素，主要分布在骨骼、牙齿、指甲和毛发中，对骨骼和牙齿硬组织的生长起着重要作用.牙齿中含微量的氟，可促进磷灰石在牙釉质表面沉积，加速釉面再矿化，提高结晶度[6].研究证实，氟基磷灰石比羟基磷灰石晶体表面积更小，使牙齿比人体骨更加坚固，可提高外来物质的侵蚀[7].常规的氟元素，在日常牙齿保护中，常以单纯的氟离子存在，如氟化钠.但牙齿中释放过多的氟离子，会减少釉质蛋白的分泌，干扰成釉细胞的调控机制，减少釉基质丝氨酸蛋白酶的合成和分泌，最终导致氟牙症的发生[8].且这些氟离子，不能和其他元素形成活性物质诱导磷灰石的形成，也就不能修复受损的牙组织.而釉原蛋白，在牙釉质形成阶段，可自行组装，调控牙釉质晶体的有序生长和排列，形成纳米晶，从而使牙齿更加坚固.本研究拟采用氟基硅酸钙，在釉原蛋白诱导下，在仿生矿化液中对牙齿进行仿生矿化，在其表面形成一层致密的矿化层，并分析该矿化层的结构和晶体形态，对其力学性能进行评估及生物学表征，以获得最佳的仿生牙釉质.

1 实验部分

1.1 材料与仪器

1.1.1 材 料.

实验所用的牙釉质小片为临床上因正畸而拔掉的成人恒牙，用切割机去除根部，牙冠超声清洗，纵向切割成3 mm×3 mm×2 mm大小的牙釉质样品，然后进行抛光处理，再经乙醇溶液超声波清洗后，烘干备用.

实验所用试剂包括：硅酸钠(Na2SiO3)、硝酸钙(Ca(NO3)2)、氟化铵(NH4F)、氯化钠(NaCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钾(KCl)、三水磷酸氢二钾(K2HPO4· 3H2O)、 六水氯化镁(MgCl2· 6H2O)、 盐酸(HCl)、二水氯化钙(CaCl2·2H2O)、十水硫酸钠(Na2SO4·10H2O)，均购自成都科龙化工试剂厂；三羟甲基氨基甲烷(HN2C(CH2OH)3)，购自Sigma公司；RPMI-1640培养基，购自Gibco公司.

1.1.2 仪 器.

实验所用仪器包括：PW2404型X射线光电子能谱仪(飞利浦公司)；TCS SP8型激光共聚焦显微镜(徕卡仪器有限公司)；Infinite200 Pro型多功能酶标仪(帝肯(上海)贸易有限公司)；JSE-5900LV型扫描电子显微镜(日本电子株式会社)；HV-1000型显微维氏硬度计(上海比目仪器有限公司).

1.2 实验过程

1.2.1 氟基硅酸钙制备.

1.2.2 仿生矿化液配置.

1.2.3 实验流程.

实验流程为：将处理好的牙釉质小片清洗干净后备用，将配置好的柠檬酸(pH=4.2)置于容量瓶中，将牙釉质小片酸蚀30 s后，用清水冲洗，然后用小牙刷蘸取氟基硅酸钙粉体在牙釉质表面轻轻刷涂，模拟刷牙的形式，刷1 min后，用清水冲洗；取配置好的仿生矿化液，将0.2 μg猪釉原蛋白(P173)溶液滴定到矿化液中，调节pH值到7.4～7.6，再将上述处理的牙釉质小片放在溶液中，置于37.2～37.6 ℃恒温水浴箱中振荡浸泡24～48 h，获得仿生矿化材料层.实验对照样为未加釉原蛋白的矿化液处理样.实验材料的仿生矿化流程如图1所示.

图1氟基硅酸钙在诱导牙齿仿生矿化的流程

1.3 材料表征

在材料表征中，氟基硅酸钙材料的成分通过X射线光电子能谱仪测定；仿生矿化层的显微结构通过扫描电子显微镜观察，并通过X射线能谱分析(EDX)测试矿化层的主要成分比;矿化层的力学性能通过显微维氏硬度计测定，测定5个样品，取平均值.

1.4 细胞实验

在常规的体外细胞培养实验中，将经仿生矿化处理的牙釉质小片，用70%酒精消毒15 min后，再通过紫外光照30 min杀菌消毒后备用，然后将样品放在培养皿中，与骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)在体外共培养1、2、3 d.细胞培养液的成分为RPMI-1640与10%胎牛血清(FCS)，将100 μL含细胞大约为1×106个/mL的培养液直接种植在各个试样中(试样置于96孔细胞培养板中)，经过24 h后细胞附着在试样上，然后再往试样上添加2mL的培养液，之后将试样放置在37 ℃，5% CO2的环境下进行细胞培育，并且每24 h换一次培养液.

为了观察细胞的贴壁及生长情况，本研究使用激光共聚焦显微镜观察细胞增殖及分化等，并通过多功能酶标仪计算细胞的生物活性.

2 结果与分析

2.1 仿生矿化层的显微结构

试样的仿生矿化层的显微结构如图2所示.

由图2可知，试样经过氟基硅酸钙处理后，在牙釉质表面形成了一层矿化层(见图2(a))，呈纳米多层状的短柱状纳米晶粒团聚体，且中间有微孔隙，孔径大小为2～20 nm，粒径大小为30～80 nm.而试样经过氟基硅酸钙处理后，在釉原蛋白诱导下的矿化液中，牙釉质表面形成簇状短棒状结晶(见图2(b))，结构类似于牙釉质的纳米磷灰石，且按一定方向有序簇状生长.进一步分析可知，2个样品的材料表面化学成分也类似，在较短实验时间内矿化层的钙磷比(1.42)接近于牙釉质钙磷比(1.45).事实上，釉原蛋白诱导氟基硅酸钙形成的仿生矿化结构，与很多因素有关，如理化条件、pH值等，且釉原蛋白中的一种异形体具有信号分子作用，能够改变细胞的表达，促进骨细胞的分化和牙周组织的再生.形成的有序的短棒状簇状结构，主要是釉原蛋白的磷酸化基团对自组装形成高度有序的结构具有潜在的影响[10].磷酸化基团的疏水结构通过pH值、温度及生理条件来调节，控制其离子强度和釉原蛋白的结构，并进一步加强蛋白质和蛋白质、蛋白质和矿物质的相互作用.同时，磷酸化基团的低溶解性易形成聚集物，并以固态或凝胶状形式存在，这种溶解和未溶解的釉原蛋白共存在早期的釉质矿化中，可形成“纳米球"，为晶体的发生和成长方向提供了有机的微观结构[11].因此，釉原蛋白诱导矿化过程中，调控牙釉质的矿物质形成，且它与钙离子较强的亲和性使其对矿物的形成具有促进和抑制的双重调节功能，从而影响特定晶面发生择优取向，影响矿物的形核和形貌.在釉质晶体形成的早期阶段，釉原蛋白的浓度等因素影响着磷酸八钙(OCP)的晶体结构，导致其晶体沿着c 轴快速生长，形成有序化的矿化相.

图2仿生矿化层显微结构及对应的Ca/P比

2.2 力学性能测试

通常，正常牙齿的维氏硬度值在240～350之间[12].本研究试样的牙釉质仿生矿化层力学结果如图3所示.

FCS为氟基硅酸钙处理； A-FCS为釉原蛋白诱导氟基硅酸钙处理

图3仿生矿化层的力学性能对比

由图3可知，单纯的氟基硅酸钙(FCS)在仿生矿化液中诱导形成的矿化层力学性能,处理5 d后，其维氏硬度为290±10.而釉原蛋白诱导氟基硅酸钙(A-FCS)在矿化液中，5 d后所形成的矿化层，其维氏硬度为320±10，力学性能优于单一氟基硅酸钙材料仿生所形成的矿化层.

2.3 细胞结果

牙釉质试样小片经过仿生矿化处理24 h后，消毒，与骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外共培养24、48、72 h后，其激光共聚焦显微镜图片如图4所示.

FCS为氟基硅酸钙； A-FCS为釉原蛋白诱导氟基硅酸钙

图4牙釉质小片经过仿生矿化后，与骨髓间充质干细胞

(MSCs)体外培养不同时间(a)及在48h细胞的活力(b)

由图4可知，材料体外细胞培养结果随着时间的延长，细胞逐渐增殖、分化，表现出良好的生物相容性与促进细胞增殖能力(见图4(a)).与单一的氟基硅酸钙材料(FCS)相比，釉原蛋白诱导下的氟基硅酸钙材料(A-FCS)细胞数量增加，密度较大，且细胞活力均较好(见图4(b)).实验结果表明，材料的表面结构对细胞的增殖与分化有一定的影响，但两种矿化结构均表现出较好的生物相容性.

3 结 论

本研究表明，釉原蛋白诱导氟基硅酸钙，采用正常的理化条件，如口腔的pH值和温度等，在仿生矿化液中诱导晶体生长可形成仿生矿化层，其结构类似于正常的牙齿的结构，晶格有序排列且能等定向生长，力学性能较好，且仿生矿化层具有较好的生物相容性，细胞可贴壁生长，且增殖分化.本研究方法可构建微纳米结构的釉质组织，并修复受损的牙齿及促进其再生.下一步的动物模型需要进一步评估该材料在牙槽骨中诱导釉质的生成.