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响应面分析法优化亚麻籽粕水解工艺研究

2019-08-27冯结铧娄华钟先锋区锡敏耿涛

中国调味品 2019年8期
关键词:饼粕亚麻底物

冯结铧,娄华,钟先锋*,区锡敏,耿涛

(1.佛山科学技术学院 食品科学与工程学院,广东 佛山 528231;2.广东省传统发酵食品工程技术研究中心,广东 佛山 528231;3.广东省食品流通安全控制工程技术研究中心,广东 佛山 528231;4.佛山市酿造工程技术研究中心,广东 佛山 528231;5.佛山农业生物制造工程技术研究中心,广东 佛山 528231;6.深圳诚致生物开发有限公司,广东 深圳 518000)

亚麻(Linumusitatissimum),又称胡麻,亚科属亚麻科植物,是世界上最古老的经济作物之一[1]。我国是亚麻的主产国之一,亚麻种植面积和产量仅次于加拿大,主要分布于我国的西北、华北地区[2]。亚麻籽(flaxseed)为亚麻的种子,其主要营养成分为脂肪(40%~45%)和蛋白质(20%~25%),此外含有较高的膳食纤维和木酚素等成分[3-5]。目前,亚麻籽的加工主要集中在榨油上,榨油后剩余大量的副产物饼粕,大部分当成废弃物处理,其含有的大量蛋白质、氨基酸等营养成分并未被充分利用,造成了资源浪费[6]。

研究表明,亚麻籽饼粕中蛋白质含量高达35%以上,其中氨基酸总量超过15%,氨基酸的组成和比例符合或接近WHO/FAO规定的适宜人体氨基酸模式的要求[7]。如:亚麻分离蛋白(flaxseed protein isolate)中赖氨酸/精氨酸的比率为0.25,这是心脏健康食品和婴儿奶粉配方期望的比值[8]。有研究报道,亚麻籽蛋白生物活性肽具有抗糖尿病、降血压等功能[9,10]。由此可见,亚麻籽粕有望成为优质的蛋白质和氨基酸资源。

目前,植物蛋白质的提取方法主要有碱提酸沉法、泡沫分离法、酶法、超声辅助法等[11-14]。其中,酶法条件温和,环境友好,目前已被广泛应用于蛋白质、油脂、纤维素等物质的提取分离研究。超声是利用机械效应和空化效应,促进物质的破碎,从而提高产物得率[15]。研究表明,适当的超声处理可有效提高亚麻籽粕蛋白提取率[16]。

鉴于亚麻籽粕潜在的高附加值,本文拟采用超声波处理,结合双酶水解方法,对亚麻籽粕进行水解,以水解度为考察指标,在单因素试验的基础上,通过响应面试验进行水解方案的优化,旨在为亚麻籽粕制备功能性短肽、氨基酸提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亚麻籽粕:深圳诚致生物开发有限公司;碱性蛋白酶、中性蛋白酶:北京奥博星生物技术有限责任公司;甲醛溶液(AR)、NaOH溶液(AR):天津大茂化学试剂厂。

1.2 仪器设备

ME104型分析天平、FE28-Standard酸度计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SY-2230恒温水浴锅 美国精骐有限公司;JYL-C50T型多功能粉碎机 九阳股份有限公司;Sonics VCX800超声破碎仪 美国Sonics公司;L-550低速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;安捷伦1260型高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司。

2 试验方法

2.1 亚麻籽粕前处理

将亚麻籽饼粕粉碎,过100目筛,得到亚麻籽粕粉末,备用。

2.2 超声辅助酶法水解亚麻籽粕工艺

称取一定量的亚麻籽粕粉末,加入蒸馏水配制成底物浓度为3%的样品溶液,超声处理10 min,滴加少量NaOH溶液(0.1 mol/L)调节反应体系pH,再加入一定量的复合酶(碱性蛋白酶∶中性蛋白酶为1∶1),在设定的温度下恒温水浴酶解,水解结束后,升温灭酶(100 ℃下水浴10 min),自然冷却,5000 r/min下离心10 min,取上清液测定水解度。

2.3 单因素试验设计

针对超声频率、加酶量、pH、温度、水解时间5个影响因素,以水解度为考察指标,分别进行单因素试验。控制底物浓度为3%,每个单因素设置5个变量,即超声频率(5000,6000,7000,8000,9000 Hz)、加酶量(1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%)、pH(7.8,8.2,8.6,9.0,9.4)、温度(35,40,45,50,55 ℃)、水解时间(2.5,3,3.5,4,4.5 h),每组试验重复3次,结果取其平均值。

2.4 响应面试验设计

根据单因素试验结果,选取超声频率、加酶量、pH、温度4个因素,以水解度为响应值,根据Box-Behnken中心组合设计四因素三水平试验,其试验因素水平见表1。

表1 响应面分析法试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2.5 水解度的测定

采用甲醛滴定法[17]:取3 mL水解灭酶后的酶解液,置于200 mL烧杯中,加入50 mL蒸馏水,加入少量碱液调节pH为8.20,再加10 mL中性甲醛溶液, 用0.1 mol/L NaOH标准溶液调节体系pH值至9.20,记录消耗NaOH标准溶液体积为V(mL)。

同时取未酶解相同浓度蛋白质溶液3 mL,按上述方法作空白试验,记录消耗NaOH标准溶液体积为V0(mL)。DH按下式计算:

式中:c为NaOH标准溶液浓度,mol/L;V为酶解液消耗NaOH标准溶液体积,mL;V0为空白液消耗NaOH标准溶液体积,mL;0.014为氮毫克当量;N为底物样品总氮含量。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 超声频率对亚麻籽粕水解度的影响

图1 超声频率对水解度的影响Fig.1 Effect of ultrasonic frequency on the degree of hydrolysis

由图1可知,随着超声频率的增大,水解度也逐渐增大,在超声频率为7000 Hz时,水解度达最大值,随后随着超声频率的继续增大,水解度明显下降。这是由于超声频率增大,空化作用加剧,细胞壁破裂能力增强,从而增大了分子热运动速率,增加了蛋白质的溶解度,从而使水解度增加[18]。但当超声频率超过7000 Hz时,可能是由于频率的继续增大,空化趋于饱和,并破坏了蛋白质的结构,使蛋白质变性,因此水解度降低。故初步得出最适超声频率为7000 Hz。

3.1.2 加酶量对亚麻籽粕水解度的影响

图2 加酶量对水解度的影响Fig.2 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis

由图2可知,随着加酶量的增大,亚麻籽粕的水解度逐渐提高,酶添加量达到2.5%之后,继续增加加酶量,水解度增加的趋势减缓。这是由于酶浓度较低时,底物过量,酶与底物接触充分,随着酶浓度的增加,水解程度逐渐增大。当加酶量达到一定限度时,酶分子与底物的结合趋于饱和,过量的酶与底物不能充分接触,因而无法作用底物,水解度也将趋于平衡[19]。初步得出最适加酶量为3.5%。

3.1.3 pH对亚麻籽粕水解度的影响

由图3可知,pH在7.8~8.6范围内,pH越小,越接近中性蛋白酶的最适pH,随着pH值增大,水解度逐渐下降,这是由于逐渐偏离了中性蛋白酶的最适pH,而未达到碱性蛋白酶的最适pH。当pH>8.6之后,水解度逐渐上升,在pH为9.4时,水解度达到最大值。酶与底物均是蛋白质,pH会影响酶和底物分子上氨基、羧基等基团的解离状态,从而影响酶与底物的结合,进一步影响酶对底物的催化效率。在水解过程中采用两种或多种蛋白酶,由于其具有不同作用位点,水解效果会优于运用单一酶[20]。初步确定最适pH为9.4。

图3 pH对水解度的影响Fig.3 Effect of pH value on the degree of hydrolysis

3.1.4 水解温度对亚麻籽粕水解度的影响

图4 水解温度对水解度的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

由图4可知,亚麻籽粕水解度随着温度的升高呈现先上升后下降的趋势。温度较低时酶活也较低,水解速度慢,而当温度升高时,蛋白酶会因变性而失活,造成水解度的下降。当水解温度为50 ℃时,水解度达到最大值,因此初步确定最适反应温度为50 ℃。

3.1.5 水解时间对亚麻籽粕水解度的影响

图5 水解时间对水解度的影响Fig.5 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis

由图5可知,时间对水解度的影响效果不显著。在2.5~4.5 h范围内,随着酶解时间的延长,亚麻籽粕水解度逐渐提高,但水解度提高的速率较慢。随着水解时间延长,底物浓度会逐渐降低,当酶与底物的作用达到饱和时,水解度的变化将趋于平缓。与其他因素(超声频率、加酶量、pH、温度)相比,时间对水解度的影响程度较低。由于考察的时间范围较窄,可能在此时间范围内底物浓度降低的速率较慢,从而使水解度的变化不明显。

3.2 响应面优化模型的建立

响应面法是一种综合试验设计和数学建模的优化方法,通过对指定的样本点的集合进行有限的试验设计,拟合出输出变量(系统响应)的全局逼近来代替真实响应面[21]。与正交试验相比,该法的优势在于:可有效减少试验次数,给出直观三维立体图和等高线图,并可考察不同因素之间的交互作用。

根据Box-Behnken中心组合设计原理,选取超声频率、加酶量、pH、温度4个因素,以水解度为响应值,建立四因素三水平试验模型,各组试验的参数组合及试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及试验结果Table 2 Design and results of response surface experiment

续 表

用Design Expert 8.0.6软件对表2的结果进行多元回归拟合,得到的回归方程为:Y=+29.15+0.89A+2.36B+1.18C+1.46D-2.02AB-1.17AC-0.95AD+0.090BC-0.41BD+0.092CD-2.31A2-1.77B2-0.30C2-3.20D2。

表3 方差分析(水解度)Table 3 Analysis of variance(degree of hydrolysis)

注:p<0.001代表极显著,用“+++”表示;p<0.01代表较显著,用“++”表示;p<0.05代表显著,用“+”表示;p>0.05代表不显著。

由表3可知,模型p值<0.0001,极显著;失拟项p值为0.0539>0.05,不显著,说明该模型的选择是合适的。此外,该模型的决定系数R2=0.9811,校正决定系数RAdj2=0.9621,说明水解度的实测值与预测值之间有较好的拟合度。从对水解度的影响来看,一次项B,C,D对亚麻籽粕水解度的影响均达到极显著水平,一次项A对水解度的影响较显著,影响顺序为B>D>C>A,即加酶量>温度>pH>超声频率。交互项AB对水解度的影响极显著,AC、AD对水解度的影响较显著,而BC、BD和CD对水解度的影响不显著。综上分析可知该模型与实际情况拟合较好,可应用于亚麻籽粕水解工艺的优化。

两因素之间交互作用的3D曲面图见图6。等高线的形状越接近椭圆说明两因素间的交互作用越显著。

图6 各因素交互效应的响应曲面(水解度)Fig.6 Response surface figures of interaction effect of various factors (degree of hydrolysis)

由图6a可知,pH和水解温度一定时,水解度随加酶量(1.5%~3.5%)增加而增大;随着超声频率的增加,水解度先升高后降低;超声频率固定时,随着加酶量的增加,水解度逐渐升高。响应曲面呈抛物线,且等高线形状为椭圆,说明加酶量和超声频率的交互作用显著。由图6b可知,水解温度和加酶量一定时,随着pH (7.8~9.4)增大,水解度逐渐增大,随着超声频率的增加,水解度先升高后降低;从等高线形状可看出超声频率和pH的交互作用显著。由图6c可知,加酶量和pH不变时,随着水解温度(35~55 ℃)升高,水解度先升高再降低,随着超声频率(5000~9000 Hz)增加,水解度先上升后下降;当水解温度为45 ℃、超声频率为6000 Hz时,水解度最高。由图6d可知,温度和超声频率一定时,随着pH增加,水解度缓慢增大;水解度随着酶添加量的增加而增大。由图6e可知,当pH和超声频率不变时,随着水解温度升高,水解度先逐渐升高后下降;随加酶量的增加,水解度逐渐升高。由图6f可知,当超声频率和加酶量一定时,随着水解温度升高,水解度先逐渐升高后下降;温度固定时,随着pH增加,水解度逐渐增大;当水解温度为45 ℃、pH为9.4时,水解度达到最大值。加酶量的等高线比温度、超声频率、pH的等高线密集,说明加酶量对亚麻籽粕水解度的影响较其他因素显著,与方差分析结果一致。

3.3 水解试验的优化与验证

通过Design Expert 8.0.6软件优化后的最佳水解条件是:超声频率5924.85 Hz,酶添加量3.47%,pH 9.40,水解温度47.60 ℃,此时预测水解度31.49%。为方便实际的操作,将水解条件调整为超声频率6000 Hz,酶添加量3.5%,pH 9.4,水解温度45 ℃,按此条件进行试验,测得水解度为31.72%,与预测值的相对误差为0.72%,说明方程拟合较好,响应面优化得到的酶解工艺参数准确,具有实用价值。

3.4 亚麻籽饼粕水解液氨基酸含量分析

亚麻籽饼粕蛋白水解过程降解为多肽和游离的氨基酸,具有较高的应用价值。对工艺优化后得到的水解液进行氨基酸分析,其液相色谱图显示了17种常见氨基酸色谱峰的保留时间及峰面积,见图7。

图7 亚麻籽饼粕水解液氨基酸色谱Fig.7 Amino acid chromatography of flaxseed meal hydrolysate

表4 亚麻籽饼粕水解液氨基酸含量Table 4 Amino acid content of flaxseed meal hydrolysate

由图7和表4可知,亚麻籽饼粕水解液中游离氨基酸为2.85885 mg/mL,其中谷氨酸(Glu)含量最高(5.52694e-1mg/mL);支链氨基酸(Val、Ile和Leu)含量为8.41895e-1mg/mL;芳香氨基酸(Phe和Tyr)含量为5.00378e-1mg/mL。

4 结论

亚麻籽粕是亚麻籽榨油后的副产物,但其含有的优质蛋白质并未得到充分利用。蛋白酶可有效催化大分子蛋白质水解成小分子的短肽和氨基酸,而水解度是考察蛋白质分解程度的重要指标之一。为了提高亚麻籽粕的附加值,本文以亚麻籽粕为原料,在单因素试验的基础上,通过响应面试验优化了亚麻籽粕的超声辅助双酶水解工艺。通过响应3D曲面图发现超声频率、酶添加量、pH和水解温度均对水解度有显著影响。得到的最佳水解工艺条件为:超声频率6000 Hz,加酶量3.5%,pH 9.4,水解温度45 ℃,此时亚麻籽粕水解度可达到31.72%。亚麻籽饼粕水解液中游离氨基酸总量为2.85885 mg/mL。本研究结果可为亚麻籽粕制备亚麻籽短肽及氨基酸工艺的进一步优化提供一定的理论依据。

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