耿静，韩秋霞，高文静，肖丽娇

(山东科技大学 化学与环境工程学院，山东 青岛 266590)

生存于晒盐场、盐湖和盐矿中的嗜盐微生物，种类丰富，在产生结构新颖且生物活性优质的天然化合物方面，因其所处的高渗透压、缺氧等特殊的环境，具有得天独厚的生理条件[1-3]。近年来的研究表明，嗜盐微生物能够分泌可以适应于高盐环境的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等的代谢产物，这些代谢产物大多具有耐有机溶剂和耐盐的特性，因此能够在高盐或低水活度条件下维持高活性和稳定性[4]。在庞大的嗜盐微生物群体中，中度嗜盐菌作为极端微生物的一个重要的类群，不断地被分离鉴定，研究发现其能够在0.5～1.5 mol/L盐度中拥有最佳生长能力[5，6]。通过深入的研究，发现中度嗜盐菌能抵抗外界高浓度的盐环境，并能应对盐度大范围的波动，因此，与极端嗜盐菌相比，中度嗜盐菌有分布广泛、营养要求较低、易于适应环境、工业应用价值高的优势[7，8]。蛋白酶在生命过程中承担着重要的功能，也是一种重要的工业酶制剂，目前广泛应用于洗涤剂、食品、医药、制革、纺织及废物处理等领域。然而，在高盐或低水活度条件下，普通的蛋白酶会变性失活，因此，其在高盐发酵食品或高盐污水处理等特殊领域的应用也受到了限制[9-11]。而嗜盐菌所分泌的蛋白酶，因其特殊的性质，为其在特殊领域如高盐发酵工业、洗涤和污水处理行业等的应用提供了天然保障，拓宽了普通蛋白酶的催化和应用范围，在生物技术领域内有巨大的应用价值。

相较于资源庞大的嗜盐菌菌群，对嗜盐菌蛋白酶资源的研究与利用还处于起步阶段[12-14]。本研究取样自山东潍坊昌邑某晒盐场盐浓度为21%的海盐水中，通过初步的分离纯化、生理生化鉴定以及分子生物学鉴定得到目标菌株Salinivibriosp. MK070917；进一步对菌株的生长过程和产酶特性进行探究，并在此基础上，对菌株所产的胞外蛋白酶进行酶学性质的探究。

1 材料和方法

1.1 菌株样品来源

样品为昌邑某盐场浓度为21%海盐水水平面下15 cm处水样，4 ℃暂存。带回后稀释水样并涂布，分离纯化后，斜面保藏至冰箱。

1.2 试剂和培养基

1.2.1 主要试剂

干酪素、福林酚试剂、三氯乙酸、碳酸钠、L-酪氨酸。

1.2.2 培养基

Gibbons液体培养基(GM，g/L)：酪素水解物5 g，酵母浸出物10 g，蛋白胨5 g，柠檬酸钠3 g，MgSO4·7H2O 20 g，KCl 2 g，NaCl 100 g。固体GM：添加2%的琼脂。

筛选培养基：固体GM中添加1%脱脂奶粉。

1.3 福林酚法测定蛋白酶酶活

按中华人民共和国专业标准SB/T 10317-1999《蛋白酶活力测定法》，采用福林酚法，测定蛋白酶酶活[15]。

酶活定义：在一定温度和pH值条件下，1 mL液体粗酶1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸作为1个酶活单位，用U来表示。

1.4 产蛋白酶菌株的筛选

1.4.1 菌株的初筛

纯化后的菌株点种于筛选培养基上，37 ℃倒置培养3～5 d，观察菌落周围是否出现透明水解圈。

1.4.2 菌株的复筛

1.4.2.1 粗酶液的制备

纯化后的菌株按2%(W/V)的比例接种至液体GM中，培养至72 h的菌液在8000 r/min、4 ℃的条件下离心10 min，取上清液进行测试。

1.4.2.2 菌株的复筛(平板扩散法)

脱脂牛奶-盐-琼脂扩散平板法：制作牛奶-盐-琼脂固体平板并放置牛津小杯，做标记；以空白GM做对照，未离心的菌液作为实验组1，粗酶液作为实验组2，分别加入到牛津小杯中，放入37 ℃培养箱中，放置12 h，观察。

1.5 系统发育分析

活化后的菌株委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rDNA测序。

序列采用MEGA 7.0软件中的邻接法进行系统发育树的构建。

1.6 菌株生长条件和营养物质利用

1.6.1 菌株生长条件

NaCl浓度设置为0%、5%、10%、15%、20%、25%；pH梯度为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0；温度梯度为25，30，25，40 ℃；金属离子添加为Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+，终浓度为5 mmol/L。活化后的菌株按2%(W/V)的比例接种后于200 r/min震荡培养72 h；每隔4 h取样1次，制备粗酶液，测定蛋白酶酶活。

1.6.2 营养物质的利用

以葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、麦芽糖和甘露醇为唯一碳源添加到GM中；以蛋白胨、脱脂牛奶、明胶、牛肉浸粉、胰蛋白胨、酪蛋白、酵母浸粉、酪素水解物、氯化铵、亚硝酸钠和硝酸铵为唯一氮源添加到GM中，分别按2%(W/V)的比例接种，于200 r/min震荡培养72 h，制备粗酶液，测定蛋白酶酶活。

1.7 单因素试验和最陡爬坡试验

对培养基的各组成部分进行产酶的单因素试验探索，根据单因素试验结果，分别设置4个因素的最陡爬坡试验，按照不同因素、不同水平的设置配制培养基，活化后的菌株按2%的比例接种，于200 r/min震荡培养72 h，制备粗酶液，测定蛋白酶酶活。单因素试验设置分别为：碳源梯度0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%；氮源梯度0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、2%；KCl添加终浓度0.5‰、1‰、1.5‰、2‰、2.5‰、3‰；柠檬酸钠添加终浓度1‰、2‰、3‰、4‰、5‰、6‰。

1.8 响应面法优化菌株产酶条件

根据单因素的试验结果以及Box-Behnken设计原则，4个因素分别以A(糊精)、B(蛋白胨)、C(KCl)和D(柠檬酸钠)表示，以单因素试验结果的最佳条件作为中水平，即0水平，响应面试验设计的因素和水平表见表1。

表1 菌株培养条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for optimization of strain culture conditions

1.9 数据分析

生长特性和产酶特性试验分别设置3组平行样品，按照时间间隔分别取样测定蛋白酶的酶活，取平均值，并绘制生长特性和产酶曲线；营养物质利用试验、单因素试验以及最陡爬坡试验测定3次，用SPSS 18.0进行显著性分析，显著水平(P<0.05)；响应面结果根据数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离筛选

菌株MK070917在初筛平板上产生透明水解圈，说明其具有产蛋白酶的能力，结果见图1。复筛图结果显示，空白培养基的存在并不能让筛选培养基产生透明水解圈，因此排除了空白培养基所带来的误差；而未离心的菌液和离心后的上清液均可以让筛选培养基产生直径大致相同的透明水解圈，证明菌株所产的蛋白酶为胞外蛋白酶。

图1 菌株MK070917初筛和复筛结果Fig.1 Screening and rescreening results of strain MK070917

2.2 系统发育分析

经生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rDNA测序后，返回的测序结果提交GenBank，并利用MAGE 7.0软件中的邻接法进行系统发育树的构建，结果见图2。MK070917菌株与Salinivibrio属内SalinivibriocosticolaS6的同源性为99%，系统发育分析归为同种，结合形态学和生理生化特征, 确定其为Salinivibrio属成员, 命名为Salinivibriosp. MK070917菌株。

图2 菌株基于16S rDNA序列的系统发育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of strain based on 16S rDNA sequence

2.3 菌株生长条件和营养物质利用

图3 菌株的生长特性和产酶特性Fig.3 Growth characteristics and enzyme production characteristics of the strain

菌株的生长条件测定见图3。菌株可以在5%～15%的NaCl浓度范围内生长并产蛋白酶，由图3A可知，NaCl浓度为10%时，该菌株的生长和产酶能力最大，因此，判断该菌株为中度嗜盐菌，并选择10%的NaCl浓度进行下一步生长条件的探索。由图3B可知，pH 6.0～9.0之间菌株均可以生长并产蛋白酶，pH为5.0和10.0时，菌株无法生长。pH为7.0时，其产酶的酶活均高于其他pH条件，因此选择pH 7.0为产酶的最适pH。由图3C可知，菌株于25～40 ℃之间可以生长和产蛋白酶。当温度为30 ℃时，其产酶能力最强，因此选择30 ℃为产酶的最适培养温度。由图3D可知金属离子的添加对菌株产酶的影响，Fe3+、Ni2+、Ca2+、Mn2+和Co2+的添加没有抑制菌株的产酶，但是其产酶开始的时间为42 h左右，说明上述金属离子的存在对于菌体前期的产酶具有一定的抑制作用，Cu2+和Zn2+的存在使得菌株无法正常生长，但是所有添加金属离子的菌株的产酶能力相较于未添加金属离子的原液都差。

菌株Salinivibriosp. MK070917可以利用多种营养物质作为碳源和氮源，这与已报道的嗜盐菌产蛋白酶的特点相吻合。由图4A可知，糊精作为碳源添加时，比原培养基中碳源酵母浸出物增加了0.25倍，也就是酶活增加了25%(P<0.05)，增加显著，但是甘露醇的添加使得菌株无法正常生长。由图4B可知，蛋白胨作为氮源添加时，菌株所产蛋白酶表现出来的活性最高，其他氮源的添加并没有显著的提高菌株产蛋白酶的能力，明胶和亚硝酸钠的添加甚至不能使菌株进行正常生长。胰蛋白胨作为氮源添加时，是除蛋白胨作为氮源酶活最高的氮源添加，但是胰蛋白胨的添加使得蛋白酶的酶活显著下降了33.3%(P<0.05)。因此选用麦芽糊精作为碳源替代GM中的酵母浸出物，氮源物质仍为原来的蛋白胨。

图4 菌株Salinivibrio sp. MK070917对碳源和氮源的利用Fig.4 Utilization of carbon sources and nitrogen sources by strain Salinivibrio sp. MK070917

2.4 单因素试验和最陡爬坡试验

针对单因素试验设计中对菌株产蛋白酶影响最显著的4个因素进行最陡爬坡试验的设计，分别于各因素各水平条件下接种，培养72 h，测定粗酶液酶活，见图5，依次为糊精(A)、蛋白胨(B)、KCl(C)和柠檬酸钠(D)。糊精添加量1%时，酶活达到最大，糊精添加量为2%时，高浓度的糊精抑制了菌株的正常生长，产酶能力几乎为0，糊精添加量为1.25%和0.75%时，酶活变化显著；蛋白胨作为最优氮源，其最佳的添加量为1%，蛋白胨添加量为0.75%时，酶活变化显著，而蛋白胨添加量为1.5%时，酶活变化不显著；KCl的最佳添加量为1‰，KCl添加量为0.5‰和1.5‰时，酶活变化显著；而柠檬酸钠的最佳添加量为2‰，此处为酶活最大值点，柠檬酸钠为1‰和3‰时，酶活变化并不显著。然而最优发酵条件并不一定是各个单因素所得最佳条件的简单组合，需要在单因素基础上进行响应面试验来确定最优的发酵培养条件。响应面试验各因素水平的选择为：糊精添加量0.75%～1.25%，蛋白胨添加量0.75%～1.5%，KCl添加量为0.5‰～1.5‰，柠檬酸钠为1%～3%；蛋白酶酶活作为响应值。

图5 产酶条件单因素试验结果Fig.5 Single factor test results of enzymeproduction conditions

2.5 响应面优化产酶条件

以糊精(A)、蛋白胨(B)、KCl(C)和柠檬酸钠(D)为试验因素，以蛋白酶酶活为评价指标，按照二次项回归方程进行试验。试验设计及结果见表2。

表2 Box-Benhken试验方案与结果Table 2 Design and result of Box-Benhken experiment

根据表2的试验结果，通过响应面软件处理后确定回归方程：酶活(U)=29.32-2.08A+0.58B+0.34C-1.83AB-1.33AC-0.38AD+0.63CD-2.45A2-2.00B2-1.85C2-1.96D2。

根据响应面试验结果，回归模型的方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析和显著性检测Table 3 Variance analysis and significance detection of regression model

续 表

注：“***”为极显著，“**”为较显著，“*”为显著。

由表3可知，本试验所得模型的P值为0.0076，说明模型极显著(P<0.01)；模型失拟项的P值为0.3728，说明模型失拟项不显著(P>0.05)。一次项A和二次项A2、B2、D2对模型的影响极显著(P<0.01)；二次项C2对菌株产蛋白酶的影响显著(P<0.05)。两因子试验，糊精和蛋白胨、KCl和糊精之间的交互作用显著(P<0.05)。

图6 响应面设计两因子交互作用曲面图Fig.6 Surface diagrams of two-factor interaction in response surface design

根据软件所做的响应曲面图见图5，以蛋白酶的酶活为响应值，糊精和蛋白胨的交互作用见图6A，糊精和KCl浓度间的交互作用见图6B，这2个曲面图形的顶点落在中心位置左右，区域俯视图趋近于椭圆形，说明交互作用显著；柠檬酸钠和KCl浓度间的交互作用见图6F，蛋白胨和柠檬酸钠之间的交互作用见图6E，蛋白胨和KCl浓度间的交互作用见图6D，3个曲面图形的曲线比较平稳，区域俯视图趋近于圆形，说明交互作用不显著；糊精和柠檬酸钠浓度间的交互作用见图6C，曲面图形的曲线较陡，区域俯视图形也趋近于椭圆形，然而椭圆形区域并无实线，说明交互作用并没有体现在此模型中。

通过Design-Expert 8.0.5b软件进行培养条件的优化，最优培养条件为：以Gibbons培养基为基底，NaCl浓度为10%，pH为7.0，培养温度为30 ℃，碳源为糊精，含量为0.66%；氮源为蛋白胨，含量为1.11%；KCl的含量为1.16‰；柠檬酸钠的含量为2.10‰；根据响应面试验结果得出的最优方案对培养基进行配制，以此检验响应面法所得结果的可行性，经过3次重复性试验，最终蛋白酶酶活可到30.192 U，与预期值30.12 U相比，其差异为0.5%，结果表明该模型合理可靠，所优化的最佳培养条件能够被用于蛋白酶的高效产酶培养。

自盐浓度21%的晒盐场海盐水中分离得到1株Salinivibrio属的中度嗜盐菌Salinivibriosp. MK070917，在适宜培养条件下可产胞外蛋白酶。

以Gibbons培养基为基底，对该菌株进行分离纯化后，进行菌株产蛋白酶的筛选，在筛选培养基上产生较大的透明水解圈，说明其具有较强的产蛋白酶能力；进一步对菌株的生长特性和营养物质利用进行探究，得知菌株可以生长并产酶于NaCl浓度为5%～10%、pH为6.0～9.0、温度为25～45 ℃的条件下，并可以利用葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、酵母浸出物、糊精和麦芽糖为碳源，利用蛋白胨、脱脂牛奶、牛肉浸粉、酪素水解物、胰蛋白胨、酵母浸粉、酪蛋白、氯化铵和硝酸铵为氮源；并利用单因素法结合响应面法优化了该菌株产胞外蛋白酶的最适培养条件：碳源为糊精，含量为0.66%；氮源为蛋白胨，含量为1.11%，KCl的含量为1.16‰，柠檬酸钠的含量为2.10‰。经响应面预测的最高产酶量为30.192 U，验证试验结果产酶量为30.18 U，与理论值相比差异为0.5%。

3 结论

本文所研究的可产蛋白酶的中度嗜盐菌菌株Salinivibriosp. MK070917经过优化之后，其蛋白酶的酶活显著提高，侯靖等人对嗜盐菌株Halorussussp. XZYJ18产胞外蛋白酶的研究和高瑞昌等人对嗜盐古菌Halobacteriaceaesp.产胞外蛋白酶的研究以及赵梦琴对1株嗜盐古菌产胞外蛋白酶的研究，对比发现，Salinivibriosp. MK070917所产的胞外蛋白酶粗酶，在相同的测定条件下，酶活要更高一点，开始产酶的时间也要更早一点；Mohammad Ali Amoozegar等人对Salinivibriosp. AF-2004产胞外蛋白酶的优化，对比发现，作为同Salinivibrio属的MK070917，其生长条件除pH外基本一致，产酶开始的时间和产酶趋势也相一致，但MK070917所产的胞外蛋白酶的酶活更高一点，产酶条件也更温和；Dian Siti S等人对中度嗜盐菌PseudomonasstutzeriBK AB-12所产胞外蛋白酶的研究，对比发现，Salinivibriosp. MK070917在产酶稳定性上要更高。此外，菌株所产的胞外蛋白酶可以生长于各种营养物质和含金属离子的环境中，因此，其对于富含有机质和金属离子的高盐废水的处理具有现实意义和广泛的应用价值。菌株优化得到的发酵条件较为温和，使得其在工业生产中更利于大规模的操作，实现批量生产，节能环保；优化所得碳源为糊精，糊精价格更便宜，而且流动性好，便于实现微生物生产中的恒化培养，其他成分的优化，极大地降低了培养基的成本，实现了培养基的最大化利用。