谭智文 段扬 朱立新（通讯作者）

(南方医科大学珠江医院脊柱外科 广东 广州 510280）

前列腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，它在男性患者中的致死率在全球范围内列第二位[1]。在我国，前列腺癌是70岁以上人群中病死率最高的泌尿系肿瘤，严重影响男性的健康[2]。骨转移是晚期前列腺癌的标志，而骨转移导致的相关并发症是患者死亡的主要原因[3]。因此，前列腺癌骨转移在临床治疗中仍是个棘手的问题。在前列腺癌的进展中，前列腺肿瘤微环境（prostate tumor microenvironment, TEM）扮演着重要的角色。实验已揭示了TEM中的细胞能使肿瘤细胞恶性增强，而肿瘤细胞也能反过来使TEM的恶性表型增加[4]。TEM主要由细胞外基质和一些非恶性的基质细胞组成。癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）是其中一类异质性较大的细胞群体，CAFs是基质改变的关键因子，能促进前列腺癌的进展和转移[5]。骨转移的病变是由于骨形成和骨破坏的平衡被打破，因此破骨细胞和成骨细胞都参与了这个过程。近年来已有研究表明在肿瘤骨转移中破骨细胞的活性发挥着重要的作用[6]。而miR-214-3p的表达与破骨细胞的活性密切相关[7]。目前国内外的研究主要集中在前列腺癌细胞对破骨细胞的影响上，此前有研究人员提出前列腺癌细胞的培养上清液能促进破骨细胞分化[8]。而有关前列腺CAFs对破骨细胞作用的研究则比较少。我们在本研究中分离鉴定了前列腺癌细胞和前列腺CAFs，并观察它们对破骨细胞形态和活性等方面的影响。

1.资料与方法

1.1 主要试剂

RPMI-1640（Gibco）；胎牛血清（Biological Industries）；双抗（Gibco）；淋巴细胞分离液（Sigma）；M-CSF和RANKL（Sino Biological）；RNA提取并PCR试剂盒（Takara）；MTT（Beyotime）；抗PSA抗体、抗α-SMA抗体、抗Vimentin抗体（Abcam）；TRAP染色盒（Sigma）；引物购自上海生工公司。

1.2 前列腺癌组织来源

选择于南方医科大学珠江医院手术室进行腹腔镜下根治性前列腺癌切除术的3例患者，在术前未接受放化疗。当切除前列腺癌组织后，由病理科医生选取避开坏死区的肿瘤组织，一半马上作冰冻切片在显微镜下观察，确定为癌组织或癌基质组织后，另一半即用来提取前列腺癌细胞和前列腺CAFs进行原代培养。本研究通过南方医科大学珠江医院伦理委员会的审核，所有临床标本的获取得到患者和家属的知情同意。

1.3 方法

1.3.1 前列腺癌细胞和前列腺CAFs的分离纯化 用无菌剪刀将获取的新鲜前列腺癌组织剪成1mm左右的小碎块，用含0.2% Ⅳ型胶原酶和0.1%Ⅱ型胶原酶的RPMI1640培养基在37℃中消化3 h，PBS洗涤2次，细胞沉淀吹散，用流式细胞术分选前列腺癌细胞和前列腺CAFs。分别接种到培养皿上，使用含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI1640培养基在5% CO2、37℃的培养箱内培养。48h后换液，以后每3天换液一次，细胞密度达到80%时传代，可得到纯度较高的前列腺癌细胞和前列腺CAFs。

1.3.2 前列腺癌细胞和前列腺CAFs的鉴定 取培养好的细胞接种到细胞爬片上，再放到24孔板中。用4%多聚甲醇固定细胞10min，0.2% Triton X-100 通透细胞10min。接着用山羊血清封闭30min，分别用兔抗人前列腺癌特异抗原（PSA）孵育前列腺癌细胞，用兔抗人波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）孵育前列腺CAFs，3个一抗的浓度都是1:100，在4℃下过夜。羊抗兔二抗室温避光孵育30min。最后用DAPI染核，抗荧光淬灭剂封片。荧光显微镜观察。

1.3.3 破骨细胞诱导 用含肝素的离心管取健康成年男性的外周血，用PBS按1:1稀释后，轻柔加入到等体积的淋巴细胞分离液上，室温400g离心30min，中间的白膜层小心吸出，用PBS洗2次，即为单个核细胞。使用预先用CD14抗体包被的磁珠加入细胞中，室温震荡反应30分钟，置于磁力架上进行磁分离。弃去上清，用PBS洗3次。

得到的CD14阳性细胞含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI1640培养基在5% CO2、37℃的培养箱内培养，24h后加入30ng/ml M-CSF，48h后再加入50ng/ml RANKL进行诱导。

1.3.4 前列腺癌细胞、前列腺CAFs与破骨细胞共培养 本实验采用transwell小室进行细胞共培养。对照组为破骨细胞单独培养，实验组为前列腺癌细胞或前列腺CAFs与破骨细胞共培养。破骨细胞接种在transwell 6孔板的下层，前列腺癌细胞或前列腺CAFs接种在小室上层。每2天换液，在培养达1，3，5d时取破骨细胞行MTT和PCR实验，在第7d时取破骨细胞行TRAP染色。

1.3.5 TRAP 染色 共培养7d时，使用TRAP染色盒对破骨细胞进行染色。首先用固定液在室温下固定细胞30s，超纯水洗净后，按说明书配制好染色液，加入到细胞培养皿中，37℃避光孵育1h，再用超纯水洗净，即可在显微镜下观察。细胞核多于3个的TRAP阳性细胞便为破骨细胞。

1.3.6 MTT检测细胞活性 在共培养1、3、5d用胰酶消化收集三组细胞，加入96孔板中，细胞浓度为2000个/孔。每组设置5个复孔，2个空白对照孔，分别于24、48、72h，每孔加入10 μL MTT（5 mg/ml）溶液，37℃避光孵育4h。每孔再加入100μL二甲基亚砜（DMSO），室温震荡10 min。酶标仪测定各孔490nm的OD值。

1.3.7 qRT-PCR检测miR-214表达水平 在共培养1、3、5d，使用Trizol裂解三组细胞，加入200μL氯仿，剧烈震荡，静置15min。4℃、10,000g离心15min，吸取上层水相转移到新的EP管中，加入异丙醇，混匀后静置10min。4℃、10,000R离心10min，收集RNA沉淀。晾干后用DEPC水溶解。按照Takara逆转录试剂盒和qPCR试剂盒对RNA进行逆转录、PCR反应。使用引物序列如下： U6-F：CTCGCTTCGGCAGCAC，U6-R：AACGCTTCACGAATTTGCGT，miR-214-3p-F:ACACTCCAGCTGGGACAGCAGGCACAGACAG，miRNA-qPCR-R:CTCAACTGGTGTCGTGGA。

1.4 统计学分析

计量资料平均值±标准差表示，用SPSS 17.0进行双侧t检验，P＜0.05差异有统计学意义。所有实验均重复3遍。

2.结果

2.1 前列腺癌细胞和前列腺CAFs表型鉴定

分离培养所得到的前列腺癌细胞PSA阳性表达（图1），前列腺CAFs α-SMA和Vimentin阳性表达（图2、3）。

图1 前列腺癌细胞鉴定，PSA阳性表达Fig.1 Identification of prostate cancer cells

图3 前列腺癌相关成纤维细胞鉴定，Vimentin阳性表达Fig.3 Identification of prostate cancer-associated fibroblasts

前列腺癌细胞和CAFs共培养对破骨细胞生长有不同程度的促进作用，在第7天，通过TRAP染色可以观察到，对照组TRAP阳性的多核细胞较少，大部分仍为单核细胞（图4A）；而共培养组均可见较多的TRAP阳性多核细胞，与对照组的差异有统计学意义。其中CAFs组的TRAP阳性多核细胞数目比前列腺癌细胞组的要更多，胞体也更大，分化情况更好（图4B、C）。

图4 共培养7d破骨细胞分化情况Fig.4 Osteoclast differentiation after 7d-co-culture with prostate cancer cells or prostate cancer-associated fibroblasts.

2.2 共培养对破骨细胞增殖活性的影响

共培养1d，细胞接种于96孔板24h和48h时，增殖活性无显著差异；接种于96孔板72h后检测，前列腺癌细胞组和前列腺CAFs组的增殖活性均明显上升，且前列腺CAFs组上升更多(图5A)。共培养3d，细胞接种于96孔板24 h时未见显著差异，48h和72h时可见前列腺癌细胞组和前列腺CAFs组的增殖活性显著上升，且前列腺CAFs组上升更多（图5B）。共培养5d时，在接种于96孔板24、48、72h后前列腺癌细胞组和前列腺CAFs组的增殖活性稍有上升，但未达显著差异（图5C）。

图5 共培养1,3,5d，MTT测定破骨细胞增殖情况Fig.5 MTT analysis of osteoclast actⅣity after co-culture with prostate cancer cells or prostate cancer-associated fibroblasts

2.3 共培养对破骨细胞miR-214-3p表达量的影响

共培养1d，前列腺癌细胞组和前列腺CAFs组的miR-214-3p表达均上升，其中前列腺癌细胞组差异显著（图6A）。共培养3和5d，前列腺癌细胞组和前列腺CAFs组的miR-214-3p表达均显著上升（图6B、C）。

图6 共培养1,3,5d，qRT-PCR测定破骨细胞miR-214-3p表达情况Fig.6 qRT-PCR of miR-214-3p levels in osteoclasts after co-culture with prostate cancer cells or prostate cancer-associated fibroblasts

3.讨论

前列腺癌转移对骨组织有偏好性。骨转移能导致一系列的并发症，包括持续的骨痛、骨折、脊髓压迫、甚至致残。这些症状能极大地降低患者的生活质量，临床中一般把它们统称为“骨相关事件”[6]。因此，了解前列腺癌对骨代谢的影响能对早期干预骨转移起到重要的帮助。

在转移阶段，前列腺癌细胞通过刺激破骨细胞，增强骨吸收的能力来创造出肿瘤生长所需要的空间。在这溶骨的过程中，破骨细胞的活性达到最高，而患者的生存率则会大大减少[9]。目前的研究大多集中在前列腺癌实质（上皮）细胞对破骨细胞的影响上，很少关注前列腺癌基质细胞如前列腺CAFs对破骨细胞的影响。而我们在实验中通过提取原代的前列腺癌细胞和前列腺CAFs，与原代破骨细胞共培养，分别比较它们对破骨细胞分化的影响。实验结果显示，经历了共培养后，无论在前列腺癌细胞组还是前列腺CAFs组，破骨细胞的分化和增殖活性有了不同程度的促进，与对照组相比具有显著意义。另外，在TRAP染色下，可见前列腺CAFs组的成熟破骨细胞数量更多，胞体更大，细胞融合情况更多。MTT法也显示前列腺CAFs组的破骨细胞比前列腺癌组的具有更强的增殖活性。这些结果提示前列腺癌基质细胞具有比前列腺癌实质细胞更强的促进破骨细胞分化的能力。由于CAFs是肿瘤微环境里的一种重要细胞，它能够分泌多种生长因子提升肿瘤的侵袭和转移能力。比如，前列腺CAFs的培养液里就含有丰富的白介素6来使上皮细胞的迁移能力增强[10]。所以，我们的研究结果也从另一个侧面揭示了前列腺CAFs对转移的促进作用。

miR-214-3p骨代谢疾病密切相关。最近的研究发现，在人体乳癌骨转移的组织中，破骨细胞内的miR-214-3p表达显著上升，而且骨吸收更加活跃。在裸鼠中敲除了miR-214-3p后，乳癌骨转移的进展被抑制了，骨吸收也减少了。体外实验表明高表达的miR-214-3p能极大地促进破骨细胞分化[7]。可见，miR-214-3p是破骨细胞内一个重要的调控因子。我们在共培养后，发现前列腺癌组和前列腺CAFs组的破骨细胞miR-214-3p水平显著升高，提示前列腺癌细胞和前列腺CAFs很可能是通过调控miR-214-3p来促进破骨细胞活性的。

鉴于破骨细胞在前列腺癌骨转移中的重要性，我们可以考虑把破骨细胞作为治疗的靶点。临床实验已证实双磷酸盐、狄迪诺塞麦等抑制破骨细胞活性的药物具有一定的抗肿瘤作用。另外，通过抑制破骨细胞内相关蛋白的表达，如组织蛋白酶K和整合素，也能起到拮抗骨转移的作用[11]。目前很多科学家都把miRNA制剂当作治疗疾病的一种新手段，根据本研究结果，我们猜想能通过干扰miR-214-3p的水平来抑制破骨细胞的活性水平，从而延缓前列腺癌骨转移的发生。但是由于我们现在对miR-214-3p调控破骨细胞分化的深层分子机制还未完全阐明，所以未来需要更多的研究去探索这一领域。

综上所述，本研究分离纯化并鉴定了前列腺癌细胞和前列腺CAFs，在共培养体系中检测了破骨细胞的增殖活性，发现前列腺癌细胞能增强破骨细胞的增殖能力，提高破骨细胞内的miR-214-3p水平，从而促进破骨细胞的分化生长。我们在搜索文献过程中还没有发现有与破骨细胞相关的同类型的研究，因此本研究成果有望为前列腺癌骨转移的形成机制提供新的信息。