李周敏，王 颖，冷寒雪，李心爱，康 希

(1.南京大学 金陵学院，江苏 南京 210089；2.南京晓庄学院 环境科学学院，江苏 南京 211171)

瘦肉精可以减少动物脂肪产生，增加肌肉合成，从而增加肉制品的瘦肉率。许多不法商家为了实现自身经济利益，使用瘦肉精含量超标的饲料饲喂动物，导致动物性食品中瘦肉精含量超标。人类食用瘦肉精含量过高的食物15 min～6 h后即可出现头晕、恶心、心跳衰弱、手脚颤抖等一系列临床中毒症状，严重者甚至会死亡。因此，瘦肉精在我国畜牧业产业中被列为禁用物质[1-3]。

瘦肉精种类多样，其中最常见的是克伦特罗(Clenbuterol，CLEN)和莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)。常用的瘦肉精检测方法有毛细管电泳(CE)[4-8]、高效液相色谱法(HPLC)[9-11]、气相色谱-质谱联用(GC-MS)[12-15]、液相色谱-质谱联用(LC-MS)[16-22]、胶体金层析法(GICA)[23-30]、酶联免疫吸附法(ELISA)[31-36]、化学发光免疫法(CLIA)[37-44]、免疫芯片法[45-48]等。色谱法作为一种经典的方法，具有灵敏度高、准确性好等特点，但其样品前处理步骤繁冗复杂，不但需要昂贵的仪器支持还需要专业的技术人员进行操作，检测时间长，不能满足现场检测的要求，也不利于大批量检测。免疫分析法作为一种新的检测方法，因具有操作简单、特异灵敏、精确、价格低廉等优点而备受瞩目。

本文利用重氮化法和丁二酸酐法分别合成了克伦特罗和莱克多巴胺人工抗原，建立了多残留同时检测的微阵列蛋白芯片法用于猪肝猪肉样本中克伦特罗和莱克多巴胺残留的检测。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

1.1.1 仪 器电子天平(江苏省常熟市意欧仪器仪表有限公司)；DMT-2500多管漩涡混合仪(上海柯淮仪器有限公司)；涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造公司产品)；HX-4拍打式均质器(上海沪析实业有限公司)；微孔板恒温振荡仪、洗板机、芯片分析仪(南京祥中生物科技有限公司)；聚苯乙烯离心管，枪头(美国Axygen有限公司)；微量移液器(芬兰百得实验室仪器有限公司)。

1.1.2 药品及试剂碳二亚胺盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、丁二酸酐、牛乳清白蛋白(BSA)(美国Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO)、亚硝酸钠、氯化钠、氯化钾、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、Tween 20(分析纯，南京化学试剂股份有限公司)；微孔板、克伦特罗和莱克多巴胺抗体、纳米银标记的羊抗鼠IgG、显色液A和B(南京祥中生物科技有限公司)。

1.1.3 主要溶液的配制磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)：称取4.003 1 g氯化钠，0.100 6 g氯化钾，0.716 8 g无水磷酸氢二钠，0.122 5 g无水磷酸二氢钾，溶解并定容至500 mL容量瓶。

0.5 mol/L氢氧化钠溶液：称取2.0 g氢氧化钠加入100 mL去离子水溶解，混匀。

洗涤工作液(PBS+0.05%Tween 20)：1 L PBS+500 μL Tween 20。

1.2 检测原理

参照文献[49-50]进行克伦特罗人工抗原(CLEN-BSA)和莱克多巴胺人工抗原(RAC-BSA)的合成。采用间接竞争免疫法，将合成的两种人工抗原点样后固定于多孔板内，加入一定量的标准品或样品和相应的抗体，固定在孔板底部的人工抗原和溶液中游离的标准品会与其抗体发生竞争反应。随后加入纳米银标记的羊抗鼠IgG与人工抗原上结合的抗体反应，最后加入含有银离子的还原性显色液，纳米银催化银离子还原形成肉眼可见的黑色沉淀后，测定板底灰度信号值。根据标准曲线计算样品中克伦特罗和莱克多巴胺的含量。图1为检测原理示意图。

图1 可视化蛋白芯片同时检测克伦特罗和莱克多巴胺的反应原理示意图Fig.1 Schematic diagram of reaction principle of simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine by protein chip

1.3 检测方法

依次加入50 μL标准品工作液和50 μL相应的抗体至各个蛋白芯片微孔中，以盖板膜封板，于25 ℃，600 r/min下反应30 min，洗板；再在每孔中加入50 μL纳米银标记的羊抗鼠IgG，于37 ℃，600 r/min下反应30 min，洗板；将显色A液和显色B液按1∶1比例混合均匀(现配现用)。每孔加入混合后的溶液50 μL，于37 ℃，600 r/min避光显色约12 min，洗板；将显色后的芯片放入芯片分析仪中获取图像，启用默认的芯片专用软件(MiELISA)进行自动化分析，自动生成结果报告。

1.4 样品前处理

称取(2.0±0.1) g 均质后的猪肝或猪肉样本至50 mL离心管中，加入6 mL三氯乙酸(1%，质量分数)，涡旋3 min，再在5 000 r/min转速下离心5 min；取1 mL上清液，用0.5 mol/L NaOH溶液调至pH值中性，涡旋10 s，于5 000 r/min转速下(猪肉为10 000 r/min)离心 5 min；取50 μL上清液用于检测。

2 结果与讨论

2.1 克伦特罗与莱克多巴胺人工抗原及抗体浓度的优化

在免疫分析中，抗原抗体的浓度会影响方法的灵敏度。抗原抗体的浓度高，信号值也高，但方法的灵敏度会降低。实验对抗原抗体的浓度(以稀释倍数表示)进行了优化，结果如表1～2所示。

表1 克伦特罗人工抗原和抗体的浓度优化Table 1 Optimization concentration of clenbuterol artificial antigen and antibody

表2 莱克多巴胺人工抗原和抗体的浓度优化Table 2 Optimization concentration of ractopamine artificial antigen and antibody

由表1～2中数据可知，克伦特罗人工抗原浓度为1∶30，抗体浓度为1∶200 000时，克伦特罗最高信号值位于35 000～40 000之间，信号值适中，灵敏度较高，0.5 ng/g的抑制率为35.27%。莱克多巴胺人工抗原浓度为1∶8，抗体浓度为1∶100 000时，莱克多巴胺的最高信号值位于35 000～40 000之间，灵敏度较高，0.5 ng/g的抑制率为17.75%。因此，采用克伦特罗人工抗原浓度为1∶30，抗体浓度为1∶200 000；莱克多巴胺人工抗原浓度为1∶8，抗体浓度为1∶100 000。

表3 克伦特罗和莱克多巴胺的交叉反应率Table 3 Cross-reaction rates of clenbuterol and ractopamine

2.2 交叉反应率(特异性)

测定了克伦特罗和莱克多巴胺抗体与其他瘦肉精类药物之间的交叉反应率。以不同浓度的药物与两者的抗原、抗体建立竞争抑制曲线，分别求出各自的IC50，并按照公式CR=IC50(被测药物)/IC50(干扰物)×100%计算交叉反应率CR，结果见表3。

由表3可知，克伦特罗和莱克多巴胺的抗体特异性良好，与其他瘦肉精类药物之间的交叉反应率均小于1%。可将两种抗原以微阵列形式固定于同一孔底，进行同时检测。

2.3 标准曲线的建立

根据优化的抗原抗体条件，将克伦特罗抗原以1∶30稀释后点样固定于微孔板底部，抗体1∶200 000稀释，6个标准品含量分别为0、 0.07、0.15、 0.3、 0.6、1.2 ng/g。莱克多巴胺抗原以1∶8稀释后点样固定于微孔板底部，抗体1∶100 000稀释，6个标准品含量分别为0、0.05、0.1、0.2、 0.4、0.8 ng/g。用芯片分析软件提取灰度信号值，并用浓度对数(lgc，x)和抑制率(B/B0，y)作标准曲线图，克伦特罗的线性方程为y=-53.286x+14.015，r2=0.987 5；莱克多巴胺的线性方程为y=-53.510x-4.081，r2=0.990 9。

2.4 样本的加标回收实验

猪肉、猪肝样本采购于当地超市，并用质谱验证不含克伦特罗和莱克多巴胺。取4种不同的猪肉样本，每个样本各取4份，其中克伦特罗的加标水平分别为0、0.5、1、2 ng/g，莱克多巴胺的加标水平分别为0、0.2、0.5、1 ng/g。猪肉样本芯片扫描结果如图2所示，检测结果见表4。

图2 标准品和猪肉样本检测结果扫描图Fig.2 Scanning results of standard and pork sample teststandard detection hole was in red frame area,and pork sample detection hole was in yellow frame area;sample sequence was from top to bottom,from left to right,and each sample repeated 2 holes;nano silver-labeled goat anti-mouse IgG was used as quality control in each well(红色框内为标准品检测孔，黄色框内为猪肉样本检测孔；加样顺序从上往下，从左往右，每个样重复2个孔;每个孔内均设有质控，为纳米银标记的羊抗鼠IgG)

(续表4)

CompoundPorksampleAdded(ng·g-1)Found(ng·g-1)Recovery(%)RSD(%)400.172.10.50.831323.611.181017.222.07958.2Ractopamine100.025.30.20.231058.20.50.551076.610.94923.4200.005.20.20.17837.60.50.511026.510.85858.9300.007.60.20.19957.30.50.43864.810.77775.3400.013.20.20.211036.70.50.49963.310.98984.7

由表4可知猪肉样本中克伦特罗的加标回收率为75%～132%，莱克多巴胺的加标回收率为77%～107%，两者的相对标准偏差都小于10%(n=3)，符合检测要求。

用同样方法对猪肝样本进行检测，结果表明猪肝样本中克伦特罗的加标回收率为74%～106%，莱克多巴胺的加标回收率为87%～125%，检测相对标准偏差都小于10%(n=3)，符合检测要求。

2.5 实际样本的检测

应用本方法对市售的90个猪肉和猪肝样本进行了检测，检出3个克伦特罗阳性，其值分别为0.32、0.26、0.41 ng/g，均低于农业部规定的最高残留限量(0.50 ng/g)；检出2个莱克多巴胺阳性，其值分别为0.36、0.44 ng/g，均低于农业部规定的最高残留限量(0.50 ng/g)。同时将5个阳性样品使用HPLC-MS方法进行检测，其中，克伦特罗HPLC-MS的检出值分别为 0.29、 0.22、 0.36 ng/g；莱克多巴胺分别为0.31、0.41 ng/g。与本方法的结果基本一致。

3 结 论

本文建立了多残留同时检测的可视化微阵列蛋白芯片法，并用于克伦特罗和莱克多巴胺的检测。该方法具有通量大，操作简单，准确性好和精密度高等优点，可用于实际样品中上述两者残留含量的测定。