楚文庆 董 武

（内蒙古民族大学动物科学技术学院重点实验室，内蒙古通辽 025000）

布病是由布鲁氏菌属细菌所引起的一种广泛分布于世界各地的人兽共患传染。布病的主要传染源是牛、羊、猪，其中羊的布病对人的毒力性最强，致病力最高，对人的健康危害性也最大。

1 材料与仪器

omp22引物，流产型布鲁氏杆菌DNA，水，2×Taq酶，移液枪，八连管；

ZR DNA Sequencing Clean-up Kit，PCR扩增仪，高速台式离心机，电泳仪，紫外透射反射分析仪，凝胶自动成像系统；Nano Drop超微量分光光度计；甲醛溶液（40%，4%，0.4%），新洁尔灭溶液（30g/L，3g/L，0.3g/L），离心管，纯化柱。

2 方法步骤

（1）DNA扩增：①引物稀释：分别向omp22上下游引物加入228 μl与286 μL去离子水，振荡离心；取10 μl稀释液加入90 μl的水混合震荡离心。

②配制扩增体系：加入25 μl的2×Taq酶，引物各2.5 μl，2 μl的DNA，18 μl的水至八连管中，混匀封好。

③设置扩增参数：stage1：95℃×1，1min；stage2：95℃（15sec）→60℃（15sec）→72℃（30 sec）共计35个循环；stage3：72℃×1（7 min）→4℃保存。

④电泳：配制2%的琼脂糖凝胶电泳（其中加入GV-Ⅱ荧光染料），依次加入mark与DNA样本，95℃进行30 min的电泳。

⑤凝胶回收：

⑥Ligation：

成分 体积10×T4DNA Ligation Buffer 1μl T4DNA Ligase（3U/μl） 1μl PGM-T载体（50ng/μl） 1μl目的片段 2μl ddH2O 5μl

（2）无害化处理布鲁氏杆菌

①将测序结果可用且浓度为200ng/μl的DNA稀释到40ng/μl，取出10μl的40ng/μlDNA于已经做好标记的1.5 ml的离心管（tube）中；

②将不同种类不同浓度的消毒剂按照与DNA1：1的比例混合到tube中，使DNA处理时间分别为10 min，30 min，1 h以及12h；

③将处理过的DNA进行纯化，把②中的混合液转移到纯化柱中，加入240 μlSequencing Binding Buffer，离心12000 rpm，30 s；

④加入300 μl的Wash Buffer 12000rpm，30 s；

⑤重复步骤④两次；

⑥加Elution Buffer 20 μl，换一个新tube，离心12000 r，30 s；

⑦电泳：PCR总反应为30 μl体系，2×Taq酶10μl，上下游布鲁氏菌OMP引物1.5μl，DNA 1.5μl，去离子水15.5μl。95℃作用5 min，进入循环，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共计35个循环，然后72℃延伸7 min，4℃forever。

2%琼脂糖凝胶电泳，电压90V，时间30 min，凝胶成像系统观察。

3 结果分析

PFA时间依存性

不一样浓度多聚甲醛处置对布病DNA产量的影响。使用不同浓度的PFA处理布病DNA，10 min，30 min，1 h以及12h后纯化DNA产量PFA溶液不同时间不同浓度来处理布鲁氏杆菌与对照组一样，都在500bp片段左右产生明亮的条带。不同浓度（1%，2%和4%PFA）处理30min与12h后，与对照组相比，4%PFA总DNA浓度显著，但30minPFA处理的DNA总量相比于对照组有所减少，所以用4%PFA处理布氏杆菌30min即可。