孙 静，袁俊清，杨梦迪，王智煜，姚光宇，周亦一，赵 晖

1.上海交通大学附属第六人民医院肿瘤内科，上海 200233；

2.上海交通大学附属第六人民医院病理科，上海 200233

在病理学活检技术中，对骨组织进行脱钙处理是一大技术难点。然而骨组织的病理学诊断结果是恶性肿瘤骨转移患者确定治疗方案的重要依据，因此制备质量良好的骨组织免疫组织化学切片尤为重要。传统的骨组织脱钙采用强酸溶液脱钙，虽然脱钙速度快，但对组织细胞的核物质及蛋白质破坏明显，从而影响病理学诊断结果的准确性。目前乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）脱钙法取得了一定进展，EDTA是一种脱钙螯合剂，对组织破坏小，且能保存组织中的核物质和抗原物质的活性。但EDTA脱钙法也有其不足之处，EDTA脱钙液作用缓慢，一般需要4～6周，延长了病理学活检的周期。而改良的EDTA脱钙法进一步缩短了作用时间，将处理周期缩短为2周。

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤[1］，每年全球约有139万新发病例，46万死亡病例[2］，中国乳腺癌的新发和死亡病例数分别占12.2%和9.6%[3］。晚期乳腺癌常发生远处转移，骨转移的发生率大于70%，高于肺、脑等其他部位。乳腺癌骨转移患者的生存期约为2年，且常出现严重骨痛、病理性骨折、脊髓神经压迫、高钙血症等骨相关事件（skeletal-related event，SRE），患者的生活质量严重降低[4］，最终导致患者死亡。对骨转移组织进行病理学活检，明确诊断，对指导治疗、改善预后具有重要意义。本实验比较改良EDTA脱钙法与酸脱钙法在乳腺癌骨转移免疫组织化学检测中使用效果的差异。

1 资料和方法

1.1 临床资料

收集上海交通大学附属第六人民医院2012年1月—2018年1月确诊为乳腺癌骨转移的病例116例，收集患者的基本信息，如原发年龄、骨转移的性质、数量、是否发生SRE等。根据患者骨穿刺组织样本的处理方法分为两组：41例为改良EDTA脱钙组，75例为酸脱钙组。

1.2 试剂器材及样本

光学显微镜购自德国Leica公司，EDTA购自国药集团化学试剂有限公司，盐酸、甲酸、乙酸、4%甲醛溶液、乙醇均购自国药集团化学试剂有限公司。骨穿刺组织样本均取自上海交通大学附属第六人民医院患者。

1.3 脱钙液的配制

EDTA脱钙液配制：① 蒸馏水2 000 mL，等分为3份；② 1/3蒸馏水+PBS，充分溶解为A溶液；③ 2/3蒸馏水+NaOH，充分溶解为B溶液；④ EDTA+B液，充分混合为C液；⑤ A液+C液，充分混合为D液；⑥ D液加入HCl，pH值调至7.2～7.4（NaOH为85 g；EDTA为100 g；HCl为85 mL）。

酸脱钙液配制：① 4%甲醛溶液66.5%；② 盐酸5.0%；③ 甲酸10.0%；④ 乙酸2.5%；⑤95%乙醇溶液16.0%。

1.4 脱钙及切片

改良EDTA脱钙组：骨穿刺标本用4%中性甲醛溶液固定24 h，流水冲洗0.5～1.0 h，然后将标本放入20倍体积的10%EDTA脱钙液中，37 ℃摇床上振荡，每天更换EDTA脱钙液，3～5 d后采用自来水冲洗，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，连续切片数张，厚4 μm，65 ℃烤片3 h。

酸脱钙组：穿刺标本用4%甲醛溶液固定、将骨组织的穿刺标本在酸脱钙液内浸泡脱钙、常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，连续切片数张，厚4 μm，65 ℃烤片3 h。

1.5 免疫组织化学检测

EDTA脱钙组：常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；抗原修复pH=9.0 EDTA，煮沸20 min；若无抗原修复则直接水洗进入下一步；自然冷却后，充分水洗，用PBS洗3次，每次2 min；滴加一抗，37 ℃温育1 h；用PBS洗3次，每次2 min；滴加二抗，37 ℃温育0.5 h；用PBS洗3次，每次2 min；DAB显色5 min，水洗；苏木精复染2 min，水洗，蓝化数秒，水洗；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；显微镜下观察。

酸脱钙组：常规二甲苯脱蜡，水化；温育一抗、二抗，显色；蓝化，蓝化完成后，放入0.5%伊红乙醇溶液复染2 min；逐级脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；显微镜下观察。

1.6 统计学处理

用IBM SPSS statistics 24.0软件完成统计学处理，数据以±s 表示，计数资料采用t检验，等级资料采用秩和检验、χ2检验，Kaplan-Meier绘制生存曲线，结果均为双尾，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况和临床特征

2012年1月—2018年1月，收集病理学诊断为乳腺癌骨转移患者116例，其中91.4%为溶骨性骨转移，80.1%骨转移的数量为4～20个，43.1%发生内脏转移，81.9%发生SRE，78.4%原发乳腺癌为雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性，69.8%为孕激素受体（progesterone receptor，PR）阳性。

2.2 乳腺癌骨转移患者骨穿刺样本脱钙处理结果

41例为改良EDTA脱钙，75例为酸脱钙，显微镜下观察，发现改良EDTA脱钙组和酸脱钙组骨组织的结构和抗原物质均完整，但改良EDTA脱钙组骨组织损伤小于酸脱钙组，且染色效果好（图1）。

图 1 骨穿刺样本染色结果Fig. 1 Staining results of bone biopsy samples

两组患者的发病年龄、骨转移年龄、原发病灶的性质、SRE、是否内脏转移等基本情况差异无统计学意义；改良EDTA脱钙组原发乳腺癌ER的阳性率为82.9%，酸脱钙组为76.0%（P=0.39）；改良EDTA脱钙组原发乳腺癌PR阳性率（87.8%）高于酸脱钙组（60.0%）（P＜0.05，表1）。

改良EDTA脱钙组原发乳腺癌与骨转移组织免疫组织化学结果ER一致性为95.1%，明显高于酸脱钙组（69.3%）（P＜0.05，表2）；改良EDTA脱钙组中37（90.2%）例ER+，24（58.5%）例PR+，38（92.7%）例Ki-67+；酸脱钙组中，55（73.3%）例ER+，27（36.0%）例PR+，25（33.3%）例Ki-67+。改良EDTA脱钙组中ER、PR、Ki-67的阳性率分别高于酸脱钙组，且差异有统计学意义（P＜0.05，表3）。乳腺癌骨转移患者转移骨组织切片的染色结果见图2。

2.3 生存分析

ER+患者的平均生存时间为（41.09±4.26）个月，明显优于E R-[2 5.8 1±5.7 1 个月］（ P ＜0 . 0 5 ） ； P R+患 者 的 平 均 生 存 时间为（4 2.3 6±5.2 7）个月优于P R-患者[（32.92±4.25）个月］（P=0.076，图3）。

表 1 乳腺癌骨转移患者一般资料Tab. 1 General information of BC patients with bone metastasis[n (%)］

表 2 EDTA脱钙组和酸脱钙组乳腺癌骨转移患者原发与转移骨组织内分泌受体一致性情况Tab. 2 Consistency of endocrine receptors in primary and metastatic bone tissues of patients in two groups[n (%)］

表 3 改良EDTA脱钙组、酸脱钙组骨转移组织ER、PR和Ki-67情况Tab. 3 Endocrine receptor status and Ki-67 of bone metastasis tissues in two groups[n (%)］

图 2 转移骨组织病理切片染色结果Fig. 2 Results of pathological staining of metastatic bone tissues

图 3 患者生存曲线Fig. 3 Patient's survival curve

3 讨 论

骨组织脱钙是病理学活检的一大难题，而且各种恶性肿瘤骨转移的发生率较高，其中乳腺癌骨转移的发生率高达70%[5］，所以采用合适的骨组织脱钙方法进行病理学检查对乳腺癌骨转移的诊断及指导临床治疗具有重要意义。

本研究收集2012年1月—2018年1月病理学诊断为乳腺癌骨转移患者临床资料，统计发现乳腺癌骨转移患者多为多发溶骨性骨转移，常合并内脏转移，且SRE的发生率高。所以免疫组织化学检查骨转移组织ER、PR的状态对指导患者治疗、改善预后具有重要意义。本文以骨组织为研究对象，分析用改良EDTA脱钙法及传统的酸脱钙法进行脱钙处理，检测两组骨组织的损伤情况。结果发现，改良EDTA脱钙法和酸脱钙法都能较完整地保持细胞的结构和形态，但是改良EDTA脱钙组的骨组织染色效果优于酸脱钙组。EDTA脱钙法能够更好地保持骨组织中的抗原物质，但是标本处理需要2周时间，不利于快速诊断。吴拮等[6］认为EDTA脱钙液的优点是对骨组织损伤小且H-E染色效果好，但用时较长。刘大维等[7］发现改良EDTA骨组织脱钙法对骨组织的形态结构及抗原物质保存较好。同样，赵雨坤等[8］通过对小鼠骨组织的研究发现他们改良后的EDTA脱钙法，在温度4 ℃和脱钙液更换周期24 h的条件下，脱钙速度较快（7 d），且对骨组织结构和蛋白表达无明显影响。Keithley等[9］认为微波结合EDTA脱钙可以较好地保存颞骨中抗原的结构。这些研究均表明EDTA脱钙法对骨组织的保护性更好。

本实验将改良EDTA脱钙法应用于乳腺癌骨转移患者，发现改良EDTA脱钙组原发乳腺癌与骨转移组织免疫组织化学检查结果ER的一致性明显高于酸脱钙组，且ER、PR阳性患者的生存期高于阴性患者，所以准确地判断ER、PR的情况是非常重要的。乳腺癌转移骨组织免疫组织化学检查结果能够指导临床治疗，如采取内分泌治疗等[10-11］，有利于改善患者的预后。结果显示，改良EDTA脱钙组的免疫组织化学检查结果更准确，是指导患者临床治疗的更可靠依据。吴鸿雁等[12］通过硝酸、EDTA和RapidCal三种不同脱钙液对乳腺癌骨转移样本进行脱钙的研究发现，硝酸处理后标本的染色效果最差，EDTA脱钙液处理的乳腺癌骨转移组织样本在形态、免疫组织化学和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）的应用上表现出优秀的标本质量，与本研究结果相一致。Liu等[13］发现，10%的中性EDTA脱钙液对大鼠股骨形态和抗原性保存较好，是用于免疫组织化学染色的优选脱钙剂。Savi等[14］的实验结果中10%EDTA脱钙液处理的组织免疫组织化学检查效果最佳。Schrijver等[15］指出EDTA是骨组织脱钙首选，因为它处理后荧光原位杂交和DNA/RNA分离效果最好。翁丹枫等[16］实验发现，改良EDTA脱钙液处理的骨髓H-E切片质量佳，免疫组织化学染色效果好、定位准确，且具有脱钙时间较短等优势，是骨髓组织活检较为理想的脱钙液。我们的研究表明EDTA在骨组织脱钙中具有一定的优势。

本研究根据改良EDTA脱钙和酸脱钙的不同处理方法，对2012年1月—2018年1月的乳腺癌骨转移标本进行分组，对两组免疫组织化学结果中的内分泌受体阳性率进行对比分析，发现改良EDTA脱钙法处理的标本在形态学和常用免疫组织化学的应用上效果较好，能够保证免疫组织化学检测的准确性，可应用于骨组织的病理学检查，与传统的EDTA脱钙方法相比能在一定程度上缩短脱钙的时间。本研究表明，乳腺癌骨转移多为多发溶骨性骨转移，且SRE发生率高；改良EDTA脱钙法对骨组织的保护作用优于强酸脱钙，提高了病理学活检及免疫组织化学检查的准确性，对恶性肿瘤骨转移患者的病理学诊断及指导临床治疗具有重要意义。