张 鑫，张晓梅，李 会，张晓娟，史劲松，许正宏

(1. 江南大学药学院，江苏无锡214122； 2. 江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122)

L-丝氨酸作为生产多种化学品和材料的最重要30个骨架化合物之一，是一种具有重要商业价值及多种用途的氨基酸，已广泛应用于制药、食品和化妆品等领域[1]。目前L-丝氨酸的生产方法有化学合成法、蛋白水解法、生物酶法以及微生物发酵法，但化学合成法存在环境污染问题，蛋白水解法与生物酶法其成本较高，微生物发酵法因其具有成本低廉、环境污染小等优势受到国内外研究者的关注[2]。然而微生物发酵法生产L-丝氨酸的产量不高，无法工业化生产。谷氨酸棒杆菌是生产氨基酸最为重要的菌株[3]，利用其产L-丝氨酸成为了当前研究热点。

近年来，随着生物技术的快速发展，对大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的代谢工程改造取得了一定的进展。研究主要集中在增加L-丝氨酸合成途径的碳流和减少降解途径的碳流两方面，以改造提高L-丝氨酸产量。谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的L-丝氨酸代谢途径如图1所示。

加强表达目的基因；敲除目的基因图1 谷氨酸棒杆菌中L-丝氨酸代谢途径Fig.1 Metabolic pathway of L-serinein C. glutamicum

蔗糖或葡萄糖等碳源进入胞内，经糖酵解反应得到重要底物3-磷酸甘油酸，然后经过3步反应得到L-丝氨酸。3-磷酸甘油酸首先经3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH，serA编码)催化，再经磷酸丝氨酸转氨酶(PSAT，serC编码)与磷酸丝氨酸磷酸酶(PSP，serB编码)催化得到L-丝氨酸。L-丝氨酸在大肠杆菌中降解途径与谷氨酸棒杆菌中降解途径存在差异，在谷氨酸棒杆菌胞内通过L-丝氨酸脱水酶(L-serDH，sdaA编码)降解为丙氨酸，而在大肠杆菌胞内通过L-丝氨酸脱氨酶(sdaA、sdaB和tdcG编码)降解为丙氨酸，两者都通过丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT，glyA编码)催化的反应降解为甘氨酸和C1单元。Mundhada等[4]首先敲除EscherichiacoliMG1655中编码L-丝氨酸降解途径关键酶的4个基因，并加强表达3个合成途径关键酶基因与半胱氨酸转运体构建重组菌，通过补料分批补料发酵，积累12.6 g/L的L-丝氨酸。Stolz等[5]通过加强C.glutamicumATCC13032合成途径基因的表达，敲除叶酸合成途径中相关基因，并进一步敲除或者弱化降解途径，L-丝氨酸产量可以达到36 g/L。以上改造策略表明增加L-丝氨酸合成途径碳流，减少降解可以有效提高L-丝氨酸产量。

本课题组前期从土壤中筛选到一株可以直接利用糖质原料生产L-丝氨酸的野生型C.glutamicumSYPS-062[6]，再采用硫酸二乙酯(DES)对SYPS-062诱变得到高产菌株SYPS-062-33a，进一步解除L-丝氨酸对serA的反馈抑制，敲除降解基因sdaA得到菌株SYPS-062-33aΔSS，L-丝氨酸产量达到21.6 g/L[7]，同时发现重组菌副产物L-丙氨酸与L-缬氨酸较出发菌株有明显提高。敲除L-丝氨酸到L-丙氨酸的转氨酶(alaT和avtA编码)，使副产物丙氨酸的含量由9.8 g/L下降至1.52 g/L；敲除了ilvN基因C末端的249 bp，弱化了L-缬氨酸合成途径的乙酰羟酸合酶(ilvB和ilvN编码)，使乙酰羟酸合酶酶活下降，得到重组菌ΔSSAAI，L-缬氨酸含量由6.54 g/L下降到2.63 g/L，ΔSSAAI L-丝氨酸产量达到26.23 g/L[8]；在此基础上进一步通过常压室温等离子诱变(ARTP)得到高产菌株A36，L-丝氨酸产量提高为30.57 g/L，同时发现L-缬氨酸产量也提高为3.11 g/L，L-丙氨酸产量为1.70 g/L，实验结果表明L-缬氨酸仍然为主要副产物。本课题组前期采用弱化的方法改造了副产物L-缬氨酸途径，L-缬氨酸的产量有一定程度下降，L-丝氨酸的产量得到一定提高。在此基础上，笔者期望通过敲除L-缬氨酸的合成途径进一步减少副产物L-缬氨酸的积累以提高L-丝氨酸的产量。目前针对糖酵解途径(pgk)的改造，增加L-丝氨酸合成途径的碳流来提高L-丝氨酸产量的策略未见报道。

本文中，笔者拟通过加强表达磷酸甘油酸激酶(pgk)，增加L-丝氨酸的前体物质3-磷酸甘油酸供应，敲除L-缬氨酸合成途径关键酶编码基因ilvN，使碳流流向L-丝氨酸合成途径，提高L-丝氨酸的产量[9-10]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和引物

C.glutamicumSYPS-062 33aΔSSAAI(缩写为ΔSSAAI)，C.glutamicumSYPS-062 33aΔSSAAI-A36(缩写为A36)为研究室成员前期构建并保藏；大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达质粒pDXW-10为王小元教授实验室馈赠[11]；大肠杆菌JM109、谷氨酸棒杆菌敲除质粒pK18mobsacB保存于笔者所在实验室[12]；重组质粒pDXW-10-pgk和pk18mobsacB-ΔilvN为笔者自行构建。实验涉及引物见表1。

表1 文中所用到的主要引物

注：酶切位点用下划线标出。

1.1.2 试剂

蔗糖、(NH4)2SO4、NaCl等常用分析纯试剂，国药集团化学试剂有限公司；脑心浸液(BHI)、原儿茶酸等，Sigma公司；硫酸卡那霉素、生物素和盐酸硫胺素，上海生工生物工程有限公司；DNA分子操作相关试剂盒，上海捷瑞生物工程公司；高保真酶、限制性内切酶等相关工具酶，宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.3 培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10 (固体培养基再琼脂粉 20)。灭菌条件为121 ℃、20 min。

种子培养基(g/L)：脑心浸液 37、葡萄糖 20、(NH4)2SO410、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO40.2、NaH2PO40.3。灭菌条件为115 ℃、7 min。

发酵培养基(g/L)：蔗糖100、(NH4)2SO430、 KH2PO43、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.02、MnSO4·H2O 0.02、原儿茶酸0.03、生物素 5×10-5、盐酸硫胺素 4.5×10-4、CaCO360。灭菌条件为115 ℃、7 min。

谷氨酸棒杆菌感受态培养基(g/L)：蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10、吐温80 1、甘氨酸 25、异烟肼 0.04。灭菌条件为121 ℃、20 min。

谷氨酸棒杆菌电转化培养基(g/L)：蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 5、山梨醇 91、脑心浸液 18.5、琼脂粉 20。灭菌条件为121 ℃、20 min。

10%蔗糖筛选培养基(g/L)：脑心浸液 37、蔗糖 100、(NH4)2SO410、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO40.2、NaH2PO40.3、琼脂粉 20。灭菌条件为115 ℃、7 min。

1.2 方法

1.2.1 谷氨酸棒杆菌的活化及发酵

将保藏的谷氨酸棒杆菌菌液取出，置于冰上融化，于固体种子培养基平板上三区划线，置于30 ℃培养箱培养3 d，然后挑取单菌落在平板上划线，再培养3 d，使菌株活力得到充分恢复。接种于20 mL种子培养基中(根据需要加入相应的抗生素，100 mg/L)，在30 ℃、120 r/min条件下培养12～16 h。待种子OD562达到25左右时，将1 mL种子液接种到25 mL发酵培养基中，于37 ℃、220 r/min条件下发酵培养120 h，根据需要每间隔12 h进行取样。

1.2.2 加强表达pgk基因

过表达质粒的构建：以谷氨酸棒杆菌A36基因组为模板，利用引物pgk-F/pgk-R扩增基因pgk，将目的基因片段和质粒pDXW-10用EcoRⅠ、HindⅢ进行双酶切，利用T4 DNA ligase连接，得到重组质粒pDXW-10-pgk。

过表达重组菌的构建：将重组质粒pDXW-10-pgk电转至C.glutamicumA36感受态中， 30 ℃培养箱培养3 d，挑取平板上的单菌落接种到液体种子培养基中，提取质粒进行双酶切与测序验证。若都正确，则表明重组菌构建成功。

1.2.3ilvN基因的敲除

敲除质粒的构建：以谷氨酸棒杆菌A36基因组为模板，ilvN-1/ilvN-2、ilvN-3/ilvN-4为引物，经过PCR反应得到ilvN基因上下游同源臂片段。然后以上下游同源臂片段为模板利用引物ilvN-1和ilvN-4再次PCR，得到ilvN基因截短的片段。质粒pk18mobsacB和基因截短的片段用EcoRⅠ和XbaⅠ进行双酶切，然后用T4 DNA ligase酶进行连接，得到敲除质粒pk18mobsacB-ΔilvN。

敲除菌株的构建：将敲除质粒pK18mobsacB电转至C.glutamicumA36感受态中，挑取一次重组长出的单菌落接种至抗性液体种子培养基中，待其达到对数生长期后，稀释102～103倍涂布于10%蔗糖筛选平板上，30 ℃恒温培养3～4 d。再次挑取二次重组长出的单菌落至液体种子培养基中，利用引物ilvN-1和ilvN-4进行PCR与测序验证。若都正确，则表明重组菌构建成功。

1.2.4 添加不同浓度L-缬氨酸对出发菌株A36及ilvN基因敲除菌株发酵的影响

ilvN基因的缺失会影响菌株L-缬氨酸的合成，对菌株的生长可能产生影响，为维持菌株正常生长，向培养基中添加质量浓度分别为250、500、750和1 000 mg/L的L-缬氨酸，考察其对出发菌株及重组菌株发酵的影响。

1.2.5 发酵参数的测定

生物量的测定：发酵液用1 mol/L HCl稀释适当倍数，紫外分光光度计测定OD562。

发酵液中氨基酸及残糖浓度的测定：采用HPLC法测定发酵液中氨基酸产量及残糖含量[7]。

2 结果与讨论

2.1 重组菌株的构建

2.1.1 过表达质粒及重组菌株的构建

以高产菌株A36基因组为模板，利用引物对pgk-F/pgk-R进行PCR反应，得到pgk片段为1 218 bp，将该片段经双酶切后与pDXW-10质粒相连接，转化到E.coliJM109，提取质粒进行双酶切验证；然后进行重组菌株A36-pDXW-10-pgk的构建，将构建成功的质粒电转至A36感受态中，提取质粒双酶切验证，验证结果如图2(a)所示。由图2(a)可知：质粒pDXW-10条带大小为8 300 bp左右，pgk基因条带大小约为1 200 bp，表明重组菌A36-pDXW-10-pgk构建成功。

2.1.2 敲除质粒及重组菌株的构建

以高产菌株A36基因组为模板，利用引物ilvN-1/ilvN-2、ilvN-3/ilvN-4进行PCR反应，得到上下游片段为531 bp。然后以上下游片段为模板，利用引物ilvN-1和ilvN-4进行融合PCR，得到含有同源臂片段的ilvN敲除的基因片段，约1 000 bp。将该片段经双酶切后连接到敲除质粒pk18mobsacB，转化到E.coliJM109，然后提取质粒进行双酶切验证，并送至测序公司进行测序，经测序比对发现质粒pk18mobsacB-ΔilvN构建成功。然后进行重组菌株的构建，将构建成功的质粒电转至A36感受态中，在Kan抗性平板上进行一次重组，然后挑取转化子培养涂布于10%蔗糖的筛选平板进行二次重组，挑取转化子进行PCR验证，如图2(b)所示。由图2(b)可知：出发菌株的条带大小为1 500 bp左右，敲除重组菌的条带大小为1 000 bp左右，表明重组菌株A36ΔilvN构建成功。

M—标准DNA；1—EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切片段M′—标准DNA；1′、2—出发菌株；3、4—敲除重组菌图2 重组菌株的构建Fig.2 Construction of recombinant strain

2.2 重组菌株的发酵

2.2.1 重组菌A36-pDXW-10-pgk的发酵性状分析

通过加强表达糖酵解途径的基因pgk，期望增加L-丝氨酸前体物质3-磷酸甘油酸的积累，使更多的碳流进入L-丝氨酸合成途径。重组菌A36-pDXW-10-pgk与A36进行发酵，结果如图3所示。

由图3可知，菌株的糖耗以及产酸基本无差异，但生长稍有增加。结果表明加强表达基因pgk对A36发酵性能没有显著影响，可能是因为pgk催化1,3-二磷酸甘油酸生成的3-磷酸甘油酸既可能流向L-丝氨酸合成途径也可能流向TCA循环(图1)，该节点流量虽有增加，流向TCA循环导致菌株生长稍有提高，而L-丝氨酸产量变化不大。

A36-pDXW-10-pgk：ρ(残糖)(△)、OD562(□)、ρ(L-丝氨酸)(○)；A36：ρ(残糖)(▲)、OD562(■)、ρ(L-丝氨酸)(●)图3 A36-pDXW-10-pgk和A36发酵表型分析Fig.3 Fermentation profiles of strain A36-pDXW-10-pgkand A36

2.2.2 重组菌A36ΔilvN的发酵性状分析

考察敲除L-缬氨酸途径关键酶对重组菌株A36发酵的影响，结果如图4所示。从图4可以看出：敲除菌株A36ΔilvN的L-缬氨酸产量大幅度下降，只积累0.4 g/L L-缬氨酸。与A36相比，其L-缬氨酸产量下降了87%，L-丝氨酸的产量为24.96 g/L，反而下降了18.3%，糖酸转化率为0.25 g/g，下降了16.7%。在前60 h重组菌基本不积累L-缬氨酸，重组菌生长也受到明显抑制，在60 h后L-缬氨酸开始逐渐积累，使重组菌的生长得以恢复，最终重组菌最大OD562达到49.92，说明在菌株A36中敲除ilvN基因，菌株虽然没有形成营养缺陷型菌株，但会导致菌株出现生长延迟现象。当L-缬氨酸开始积累时，L-丝氨酸也开始积累，表明L-缬氨酸的添加恢复了菌株生长和L-丝氨酸的积累。

A36ΔilvN:ρ(残糖)(△)、OD562(□)、ρ(L-丝氨酸)(○)、ρ(L-缬氨酸)(◇)；A36:ρ(残糖)(▲)、OD562(■)、ρ(L-丝氨酸)(●)、ρ(L-缬氨酸)(◆)图4 A36ΔilvN和A36发酵表型分析Fig.4 Fermentation profiles of strain A36ΔilvN and A36

2.3 添加不同浓度L-缬氨酸对出发菌及重组菌发酵的影响结果

菌株前期生长受到抑制，添加一定浓度L-缬氨酸(Val)可能有助于菌株的生长与产酸。因此，考察添加不同浓度L-缬氨酸对出发菌A36及重组菌株A36ΔilvN生长和产酸的影响，结果如图5所示。由图5可知，在添加不同L-缬氨酸后出发菌株A36的L-丝氨酸产量与生长基本无变化，外源添加的L-缬氨酸并未被菌株A36利用，表明菌株A36自身生成的L-缬氨酸满足自身生长与产酸需求，不需要外源L-缬氨酸的添加。但由图5(c)可知，发酵培养基添加了不同浓度L-缬氨酸后，菌株A36ΔilvN的生长得到了恢复，L-丝氨酸产量也有提高。添加不同浓度L-缬氨酸条件下，A36ΔilvN与出发菌株A36的发酵性能见表2。

由表2可知，在添加250 mg/L L-缬氨酸时，L-丝氨酸产量为31.22 g/L，最大OD562为61.5，糖酸转化率为0.31 g/g，相比添加前分别提高了25%、23.2%和24%。当L-缬氨酸质量浓度分别提高到500与750 mg/L时，L-丝氨酸产量与OD562均有较大的提高，分别可积累32.01与34.19 g/L的L-丝氨酸。与A36ΔilvN分别提高28.2%与37%相比，糖酸转化率分别提高28%与36%。当L-缬氨酸质量浓度进一步提高到1 000 mg/L时，L-丝氨酸产量与添加量在750 mg/L时相比，反而有所下降，L-丝氨酸积累仅32.23 g/L，表明此时菌株的生长与产酸不需要过量的L-缬氨酸。从图5 (d)中可知，当添加不同浓度的L-缬氨酸时，发酵液中的L-缬氨酸的积累量也在不断增加，但L-缬氨酸的积累量均小于出发菌株A36中的积累。在添加量为750 mg/L时，L-缬氨酸积累量仅为1.42 g/L，相比出发菌株A36下降54.3%。

A36—不加缬氨酸的原始菌对照；A36ΔilvN—不加缬氨酸的重组菌对照图5 L-缬氨酸添加对A36及A36ΔilvN发酵性能的影响Fig.5 Effects of L-valine concentration on fermentation performance

表2 添加L-缬氨酸条件下A36ΔilvN与出发菌株A36的发酵性能

Table 2 Fermentation performance of A36ΔilvNunder different concentrations of L-valine and the control strain A36

ρ(L缬氨酸)/(mg·L-1)OD562ρ(L丝氨酸)/(g·L-1)ρ(L缬氨酸)/(g·L-1)YL丝氨酸/(g·g-1)PL丝氨酸/(g·L-1·h-1)A36(0)58.92±1.6330.57±0.783.11±0.170.300.25A36ΔilvN(0)49.92±1.7824.96±1.080.40±0.100.250.2125061.51±1.4631.22±0.290.82±0.220.310.2650063.50±1.8932.01±0.521.19±0.300.320.2775065.20±1.7534.19±0.681.42±0.240.340.281 00064.45±1.0432.23±0.371.86±0.360.320.27

注：YL-丝氨酸表示L-丝氨酸糖酸转化率；PL-丝氨酸表示L-丝氨酸生产强度。

3 结论

为进一步提高L-丝氨酸的产量，以高产菌株A36为出发菌株，首先采取过表达磷酸甘油酸激酶，增加L-丝氨酸合成途径碳流的方法，结果发现pgk对菌株A36的产酸无显著影响，可能是因该节点既可能流向L-丝氨酸合成途径也可能流向TCA循环，该点流量虽有增加，流向TCA循环导致菌株生长稍有提高，而L-丝氨酸产量变化不大。进一步对L-缬氨酸合成途径关键酶编码基因ilvN进行敲除，结果发现重组菌株前期不积累L-缬氨酸，菌株的生长受到限制。但在发酵的中后期，L-缬氨酸开始少量积累，此时菌株开始快速生长，L-丝氨酸也开始大量积累。进一步在培养基中添加不同浓度L-缬氨酸，发现L-缬氨酸添加量为750 mg/L时， L-丝氨酸产量达到34.19 g/L，OD562为65.2，糖酸转化率为0.34 g/g，生产强度为0.28 g/(L·h)，相比出发菌株A36分别提高了11.8%、10.6%、13.3%和12.0%。L-缬氨酸积累量为1.41 g/L，相比出发菌株下降了54.3%,表明适量L-缬氨酸的存在有助于菌株的生长与L-丝氨酸的积累。