李燕 吝佩 綦晓龙

摘 要 目的：建立HPLC法同时测定麒麟丸（制何首乌、墨旱莲、淫羊藿等）中3种成分的含量。方法：麒麟丸50%乙醇提取液的分析采用Vensuil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 mm）；以含0.05%三氟乙酸的水溶液（A）和含0.05%三氟乙酸的乙腈溶液（B）为流动相，梯度洗脱；体积流量1.2 ml/min；柱温30 ℃；检测波长220 nm。结果：橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷分别在6～18 mg/ml（r=0.999 8），3～9 mg/ml（r=0.999 8），2～6 mg/ml（r=0.999 9）范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为95.9%、93.6%、92.4%，RSD分别为1.6%、3.0%、4.6%。结论：该方法准确、重复性好，可用于质量控制。

关键词 麒麟丸 橙皮苷 丹酚酸B 淫羊藿苷 HPLC

中图分类号：O657.72； R286 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）13-0061-04

Simultaneous determination of three constituents in Qilin pills by HPLC*

LI Yan1**， LIN Pei2， QI Xiaolong2（1. Shanghai Jinpibao Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200080， China； 2. Shanghai AppTec R&D Co.， Ltd.， Shanghai 200131， China）

ABSTRACT Objective： To establish an HPLC method for the simultaneous determination of the contents of three constituents in Qilin pills （ Polygoni Multiflori Radix Praeparata， Ecliptae Herba， Epimedii Folium）. Methods： The analysis of 50% ethanol extract of Qilin pills was performed on a Vensuil XBP C18 （ 4.6 mm×250 mm， 5 mm） by gradient elution with the mobile phase comprising of acetonitrile-0.05% trifluoroacetic acid at volume flow 1.2 ml/min， 30 ℃ and detection wavelength 220 nm. Results： Hesperidin， salvianolic acid B and icariin showed good linear relationship in the ranges of 6-18 mg/ml （r=0.999 8），3-9 mg/ml （r=0.999 8），2-6 mg/ml （r=0.999 9） with average recoveries of 95.9%， 93.6% and 92.4% and RSDs of 1.6%， 3.0% and 4.6%， respectively. Conclusion： This method is accurate and reproducible and can be used for the quality control of Qilin pills.

KEy WORDS Qilin pills， hesperidin； salvianolic acid B； icariin； HPLC

麒麟丸由制何首乌、墨旱莲、淫羊藿、菟丝子、锁阳、党参、郁金、枸杞子、覆盆子、山药、丹参、黄芪、白芍、青皮、桑椹等15味中药组成，能够补肾填精，益气养血。适用于肾虚精亏，血气不足，腰膝酸软，倦怠乏力，面色不华，男子精液清稀，阳痿早泄，女子月经不调，或男子不育症，女子不孕症见有上述证候者[1]。目前，该质量标准设立了制何首乌中大黄素含量的薄层色谱扫描法作为含量测定项，文献中也仅有报道制何首乌中二苯乙烯苷的含量测定方法[2-4]，对该组方中其它成分的含量测定方法未见报道。该方中青皮具有疏肝理气、消积化滞的功效，其主要活性成分为黄酮类成分，现代药理学研究表明橙皮苷具有抗氧化和延缓衰老的作用[5-6]；丹参具有活血化瘀，通经止痛的功效，用于胸痹心痛，症瘕积聚，月经不调等。其主要活性成分为丹参酮和丹酚酸类组分。其中丹酚酸B具有抗氧化、防治动脉粥样硬化等作用[7-8]；淫羊藿具有补肾阳，强筋骨的功效，用于肾阳虚衰，阳痿遗精，筋骨痿软；淫羊藿总黄酮为其主要活性成分，其中淫羊藿苷具有增强免疫力，抗氧化和抗衰老的药理作用[9-11]。因此，本实验选择橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷为指标成分，建立HPLC方法同时测定上述3种成分的含量，为其质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；HZQ-50H加热回旋振荡器（上海一恒科学仪器有限公司）；KQ-500DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；5810R离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 试药

橙皮苷购自百灵威科技（批号L190Q57，纯度98.1%）；丹酚酸B购自成都普瑞法科技开发有限公司（批号PRF7060803，纯度98.3%）；淫羊藿苷购自南京景竹生物科技有限公司（批号JZ16121109，纯度98.7%）；麒麟丸来自广东太安堂药业股份有限公司（批号A20161101、B20180807和B20180809，60 g/瓶）；乙腈、三氟乙酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为纯凈水。

1.3 方法

1.3.1 供试品溶液制备

取麒麟丸适量研细，精密称取2 g，至100 ml具塞锥形瓶中，加入50%乙醇溶液50 ml，称定重量，37 ℃振摇30 min，再超声30 min，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，过0.45 mm聚四氟乙烯滤膜，取续滤液，即得。

1.3.2 对照品溶液制备

取橙皮苷对照品30 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，精密加入1 ml二甲基亚砜使溶解，然后加入50%乙醇溶液稀释并定容至刻度，摇匀，作为橙皮苷的对照品溶液；称取16 mg丹酚酸B，置于100 ml量瓶中，加入50%乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，作为丹酚酸B的对照品溶液；精密称取10 mg淫羊藿苷，置于100 ml量瓶中，加入50%乙醇稀释并定容至刻度，作为淫羊藿苷的对照品溶液；精密吸取上述各对照品溶液各5 ml置于100 ml量瓶中，加50%乙醇定容至刻度，摇匀，制成每1 ml含橙皮苷15 mg、丹酚酸B 8 mg、淫羊藿苷5 mg的混合对照品溶液；精密吸取2、3、4、5和6 ml至10 ml量瓶中，加50%乙醇定容至刻度，即得系列浓度的混合对照品溶液。

1.3.3 色谱条件

色谱柱为Vensuil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 mm）；流动相A为含0.05%三氟乙酸的水溶液、B为含0.05%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱（0～48 min，90%A→70%A；48～55 min，70%A→5%A）；体积流量1.2 ml/min；柱温30 ℃；检测波长220 nm；进样量10 ml。

2 结果

2.1 系统适用性

将对照品和供试品溶液分别进样测试，理论塔板数均>5 000，各峰与相邻峰的分离度>1.5（图1）。

2.2 线性关系考察

以峰面积为纵坐标（Y）、质量浓度（mg/ml）为横坐标（X），绘制标准曲线，各成分在各自浓度范围内线性关系良好（表1）。

2.3 精密度试验

同一供试品溶液连续进样6次进行测定，计算橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷色谱峰的峰面积，RSD分别为0.8%、1.5%和1.1%，表明仪器的精密度良好。

2.4 重复性试验

精密称取同一供试品（批号A20161101）粉末2.0 g，共6份，按“1.3.1”项下方法制备供试品溶液，HPLC测定并计算得橙皮苷、丹酚酸B、淫羊藿苷的RSD分别为0.8%、1.5%、1.1%，表明该方法重复性良好。

2.5 稳定性试验

取供试品溶液于0、20、50、90 h进样测定，测得橙皮苷、丹酚酸B、淫羊藿苷峰面积RSD分别为0.6%、1.2%、0.7%，说明供试品溶液在90 h内稳定性良好。

2.6 加样回收率试验

精密称取含有量已知的供试品（批号A20161101）粉末0.8 g、1.0 g、1.2 g各3份，精密加入相当于含有量的混合对照品溶液，按“1.3.1”项下方法制备供试品溶液，进行HPLC测定，结果见表2。

结果表明，高、中、低三种浓度的加样回收率均在90%～108%之间，且RSD均小于5%，说明该方法的准确度良好。

2.7 样品的含量测定

取3批次的麒麟丸按供试品制备方法制备样品，分别进行HPLC测定，结果见表3和图2。

结果显示，三批样品中橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷的色谱峰均能与其它色谱峰良好分离，且分离度均大于1.5，理论塔板数均大于5 000，说明该方法能够用于不同批次的产品检测。

3 讨论

流动相曾选择考察了乙腈-磷酸、乙腈-醋酸-醋酸铵、乙腈-三氟乙酸和不同梯度下的洗脱情况，发现在乙腈-0.05%三氟乙酸条件下洗脱色谱峰峰型和分离效果均比较好，因此选择乙腈-0.05%三氟乙酸作为流动相。

采用二极管阵列检测器，在200～400 nm范围内进行光谱扫描，发现橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷的最大波长分别为282 nm、286 nm、270 nm，此外，3种成分在波长220 nm和230 nm均有明显的吸收，因此，分别对220 nm、230 nm和270 nm波长下的色谱峰进行分析，发现220 nm波长下各成分的响应值最大，且分离度良好，因此，选择220 nm作为检测波长。

由于投料所用药材批次不同，2016年和2018年批次样品中的橙皮苷和丹酚酸B含量略有差异。但多批次检测结果表明该方法简单适用，可同时检测3个指标性成分的含量，节约检测时间和成本，为麒麟丸改进质量控制方法提供参考依据。

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