林奕云，杨 熙，林 晨，张志军，张 飞

(中国广州分析测试中心 广东省分析测试技术公共实验室，广东 广州 510070)

阿托品是一种M胆碱受体阻断药，具有解除平滑肌的痉挛、抑制腺体分泌、解除迷走神经对心脏的抑制、兴奋呼吸中枢等药理活性，在兽医临床上主要作为解毒药，缓解有机磷中毒的症状[1]。我国农业部第235号公告规定，在动物源食品中不得检出阿托品。但有一些部分商家在牛饲养过程中擅自使用阿托品注射药物，利用其抑制腺体分泌的作用，使牛因口渴而大量饮水，从而增加体重,以谋取更多的经济利益。

目前阿托品的检测方法有：气相色谱法[2]、液相色谱法[3-5]、液相色谱-串联质谱法[6-9]等。由于兽药残留的含量较低，液相色谱法灵敏度无法满足其检测要求。质谱法具有灵敏度高、专属性强的特点，为有效监控牛肉中阿托品的残留量，本文优化了提前条件、液相色谱和质谱条件，建立了超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱(UPLC-MS/MS)法测定牛肉中阿托品残留量的分析方法。该方法灵敏度高、回收率和重现性良好、结果准确可靠，可以检测牛肉中阿托品残留量，为注水牛肉的监管提供技术手段支持。

1 实验部分

1.1 仪器设备与试剂

Agilent 1290/6460A超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，美国安捷伦科技公司；XW-80A型微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器有限公司；KQ-2200型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Sartorius BSA224S 电子天平，德国赛多利斯科学仪器有限公司；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司。

阿托品(Atropine，CAS：51-55-8，纯度：99.6%)购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈，色谱纯，美国Honeywell公司；甲酸，色谱纯，美国Tedia公司；甲醇，广州化学试剂厂；磷酸二氢钾，广州化学试剂厂；实验用水为去离子水。

1.2 标准溶液配制

准确称取10.0 mg阿托品标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1000 mg/L的标准储备液，于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 样品前处理

样品均质处理后，称取5.0 g于50 mL带盖离心管中，加入20 mL 0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液：乙腈(4∶1)溶液，加盖，涡旋2 min，超声提取15 min，3500 r/min离心5 min，上清液倒入另一干净离心管中。残渣再加入20 mL 0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液：乙腈(4∶1)溶液，重复提取一次，合并两次上清液。用0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液：乙腈(4∶1)溶液4 mL洗涤滤纸，将上清液用滤纸过滤，收集全部滤液于50 mL容量瓶中，定容至50 mL，过0.22 μm滤膜上机测定。

1.4 基质匹配标准曲线的配制

称取5份空白试样，分别加入适量标准溶液，按照1.3进行处理，制成浓度为0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 ng/mL的基质匹配标准工作液。

1.5 色谱/质谱测定条件

1.5.1 液相色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)；流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液；柱温35 ℃；流速0.3 mL/min；进样量5.0 μL；梯度洗脱程序如下：0～1 min，20%A，1～3 min，20%～30%A，3～3.5 min，30%～90%A，3.5～4 min，90%～20%A，4～5 min，20%A。

1.5.2 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)，正离子电离模式，扫描方式为多反应监测模式(MRM)。鞘流气温度350℃，鞘流气流量11 mL/min，干燥气温度为300℃，干燥气流量5 mL/min，雾化器压力40 psi，毛细管电压3500 V。阿托品的MRM参数列于表1，安捷伦MassHunter软件用于定性和定量分析。

表1 阿托品的MRM参数

注：*表示定量离子对。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择

基于阿托品是碱性物质，具有易溶于水的性质，本试验比较了0.1%甲酸水溶液和0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液对阿托品提取回收率的影响，结果表明，用0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液提取，阿托品的回收率较高。由于乙腈对蛋白质具有一定的沉淀作用，本试验比较了0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液和乙腈的不同比例对阿托品提取效果的影响，结果发现，随着乙腈的比例增加，阿托品的回收率降低，当0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液-乙腈溶液为4∶1时，阿托品的提取回收率最高，沉淀蛋白等杂质的效果好，共萃物较少。因此，选用0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液-乙腈溶液(4∶1)作为提取溶剂。

2.2 色谱条件的优化

分别以乙腈-水、甲醇-水作为流动相，考察对目标化合物离子化程度的影响。结果表明，以乙腈-水作为流动相时，阿托品的响应值明显高于流动相为甲醇-水时的响应值。因此，选用乙腈-水作为流动相。

目标化合物的离子化效率还会受到流动相中加入的添加剂影响[10]。比较在水相中分别加入0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸铵对目标化合物离子化效率的影响。结果发现，在流动相中加入少量甲酸有利于目标化合物的离子化，能促进生成[M+H]+离子，提高了阿托品的响应值和检测灵敏度。因此，试验采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相，梯度洗脱。

2.3 质谱条件的优化

使用1.0 μg/mL阿托品标准溶液进样，分别在ESI+、ESI-的模式下进行全扫描，扫描发现在正离子模式下，阿托品的灵敏度更高，因此，选择择正离子模式，m/z 290.1作为阿托品测定的母离子。采用SIM扫描方式，优化出最佳碎裂电压，100 V条件下，阿托品母离子的响应最高。再采用Product Ion扫描方式，阿托品经碰撞后产生的碎片离子有m/z 93.0 和m/z 124.0，其中m/z 124.0相对丰度最高，作为定量离子，m/z 93.0作为定性离子。最后，优化出子离子的最佳碰撞能量，得到表1所示的质谱参数。最终优化了质谱条件，得到如图1所示的阿托品标准溶液的MRM色谱图，如图2所示的阳性样品和阴性样品的总离子流TIC图。

图1 阿托品的多反应监测(MRM)色谱图

Fig.1 MRM Chromatograms of Atropine

图2 样品的总离子流(TIC)色谱图

2.4 线性范围

本文采用基质匹配外标法定量，以消除基质干扰，提高定量准确性。按照1.4配制基质匹配标准曲线，以阿托品的质量浓度(x)为横坐标，色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制工作曲线。结果表明，阿托品在0.10～5.0 ng/mL的质量浓度范围内线性回归方程为Y=78036X-2015.2，相关系数r≥0.999，具有良好的线性关系，表明该方法适用于牛肉中阿托品的定量分析。

2.5 检出限和定量限

阿托品的检出限为0.5 μg/kg(信噪比S/N=3)，定量限为1.5 μg/kg(信噪比S/N=10)。

2.6 回收率和精密度

准确称取3份空白样品，每份5.0 g，加入阿托品标准溶液，添加量为1.0、5.0、10 μg/kg，按照1.3方法进行样品处理。每个添加水平测定6次，考察方法的精密度。从表2可以看出，在1.0、5.0和10 μg/kg这3种加标水平下目标化合物的平均回收率为89.5%～95.2%，相对标准偏差(RSD6)为2.07%～5.03%，表明方法的准确度和重复性较好，可满足日常分析要求。

表2 阿托品的回收率和相对标准偏差(n=6)

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定牛肉中阿托品残留量的分析方法，样品用0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液-乙腈(4∶1)溶液提取，基质匹配外标法定量，降低了基质干扰，提高了分析灵敏度。该方法样品前处理操作简单，灵敏度高、回收率和重现性良好、结果准确可靠，可用于检测牛肉中阿托品的残留量，为注水牛肉的风险监测提供技术手段支持。